Interazione tra il gruppo eme e molecole biologiche come fonte di stress ossidativo e nitrativo

The heme group, present inside the cells in a strictly controlled amount, interacts with reactive oxygen (ROS) and nitrogen (RNS) species, promoting oxidative and nitrative reactivity towards different targets. In physiological conditions the reactivity of the heme group is not particularly relevant to the redox equilibrium of the cells, but when its concentration inside neurons raises, its reactivity raises consequently and becomes relevant, and may lead to neurological pathologies such as Alzheimer’s disease. Moreover, the heme group binds neuronal peptides as amyloid-β (Aβ) peptides, forming complexes that modulate its catalytic activity. In this study, kinetic parameters describing the catalytical behavior of the hemin-Aβ(1-16) complex were obtained, indicating that hemin exhibits a rich reactivity even if it is degraded quicky when coordinated to a peptide. The modulation of heme reactivity through coordination is not only important from a physiological point of view, since its binding to a peptide can also be exploited to develop new bioinspired redox catalysts. In this context, the SpyTag/SpyCatcher (STSC) technology, which consists of an oligopeptide that spontaneously binds a protein scaffold through an isopeptide bond, can be exploited. If the peptide sequence is designed to interact with the heme group, the STSC adduct can act as a catalyst able to interact with ROS, with a predictable selectivity given by the presence of the protein scaffold. In this study, the complexes between the heme group and two different SpyTag sequences and their adduct with SpyCatcher protein have been characterized. In particular, their formation equilibria and their pseudo-peroxidase reactivity have been investigated, assessing a non negligible affinity between the heme group and the peptides or adducts but also a tendency of these complexes to precipitate, although a moderate activity towards different substrates has been detected. The reactivity of the heme group has been studied also in a different biological context, the bacterial cytochrome c peroxidase from Neisseria gonorrhoeae (NgBCCP), that is the pathogen causing the gonorrhoeae disease. This enzyme contains two heme groups and represents a defense mechanism for the bacterium. In this context, the interaction of NgBCCP with the peroxynitrite anion, a species with a high nitrating power, has been investigated, to assess whether it could act and as an alternative substrate for the enzyme. In particular, the enzyme activation given by peroxynitrite has been studied, as well as its peroxidase reactivity. This project is still ongoing, but preliminary results indicate that peroxynitrite is able to bind and activate NgBCCP, showing kinetic parameters for the peroxidase activity similar to those estimated in the presence of hydrogen peroxide. Iron could play a role in neurodegenerative pathologies even when it is not inside the heme group but is coordinated by other ligands. This is the case of the iron inside neuromelanins (NMs), dark pigments constituted by melanic, protein, lipidic and inorganic moieties linked between each other by covalent bonds. This pigment shows both a neuroprotective and a neurodegenerative role, being involved in the pathogenesis of Parkinson’s disease. In this work, the influence of nitrative stress on the synthesis of NM models has been studied. The results show that nitration on the protein portion does not affect the melanization process, while complete nitration on the melanic portion totally prevents it.

Il gruppo eme, presente all’interno delle cellule in quantità strettamente controllata, interagisce con specie reattive all’ossigeno (ROS) e all’azoto (RNS), promuovendo reattività ossidativa e nitrativa verso vari bersagli. Quando la concentrazione del gruppo eme all’interno dei neuroni aumenta, di conseguenza anche la sua reattività aumenta e diventa rilevante per l’equilibrio redox della cellula, e potrebbe portare allo sviluppo di patologie neurologiche come la malattia di Alzheimer. Inoltre, il gruppo eme lega peptidi neuronali come i peptidi β-amiloidi (Aβ), formando dei complessi che modulano la sua attività catalitica. In questo studio sono stati calcolati i parametri cinetici che descrivono il comportamento catalitico del complesso emina-Aβ (1-16) e i risultati ottenuti indicano che l’emina, quando è coordinata da un peptide, anche se viene degradata velocemente mostra una ricca reattività. La modulazione della reattività del gruppo eme attraverso la sua coordinazione è importante anche perché il suo legame a un peptide può essere sfruttato per sviluppare nuovi catalizzatori redox bioispirati. In questo contesto, si può sfruttare la tecnologia SpyTag/SpyCatcher (STSC), che consiste in un oligopeptide che spontaneamente si lega covalentemente a una proteina tramite un legame isopeptidico. Se la sequenza del peptide è disegnata in modo da poter interagire con il gruppo eme, l’addotto STSC ottenuto può agire da catalizzatore, interagendo con le ROS con una selettività che potrebbe essere conferita dalla presenza dello scaffold proteico. In questo studio sono stati caratterizzati i complessi tra il gruppo eme e due diverse sequenze di SpyTag oppure il loro addotto con una proteina SpyCatcher. In particolare, sono stati analizzati gli equilibri di formazione dei complessi e la loro reattività pseudo-perossidasica, rilevando un’affinità non trascurabile tra il gruppo eme e i peptidi o il loro addotti, ma anche una tendenza alla precipitazione di questi complessi, nonostante sia anche stata misurata una moderata attività catalitica verso diversi substrati. La reattività del gruppo eme è stata studiata anche in un diverso contesto biologico, la citocromo c perossidasi batterica da Neisseria gonorrhoeae (NgBCCP), il patogeno responsabile della gonorrea. Questo enzima contiene due gruppi eme e costituisce un meccanismo di difesa per il batterio. In particolare, è stata indagata l’interazione tra NgBCCP e l’anione perossinitrito, una specie che possiede un forte potere nitrante, per capire se tale anione potesse fungere da substrato alternativo per l’enzima, studiando l’attivazione dell’enzima da parte del perossinitrito e la sua attività perossidasica. Questo progetto non è ancora terminato, ma i risultati preliminari indicano che il perossintrito è in grado di legare e attivare NgBCCP, mostrando parametri cinetici per l’attività perossidasica simili a quelli stimati in presenza di perossido di idrogeno. Il ferro può avere un ruolo in patologie neurodegenerative anche quando non è inserito all’interno del gruppo eme, ma è coordinato da altri leganti. E’ questo il caso del ferro contenuto all’interno della neuromelanina (NM), pigmento costituito da componenti melaniche, proteiche, lipidiche e, appunto, inorganiche, legate covalentemente tra loro. Questo pigmento svolge un ruolo sia neuroprotettivo che neurotossico e può essere coinvolto nella patogenesi del morbo di Parkinson. In questo lavoro è stata studiata l’influenza dello stress nitrativo sulla sintesi di modelli di NM e i risultati mostrano che la nitrazione sulla porzione proteica non influenza la reazione di melanizzazione, mentre la nitrazione completa della porzione melanica la impedisce.