Coniugati con OncoFAP per il trasporto mirato al tumore di molecole citotossiche, radionuclidi e immunostimolatori

Conventional chemotherapeutic drugs are the treatment of choice for a wide variety of both liquid and solid tumors. However, most of these drugs are unable to localize selectively at the tumor site, leading to severe side effects. Targeted delivery represents a successful strategy to enable the selective accumulation of different therapeutic payloads at the site of disease, such as cytotoxic drugs, radionuclides, and immunomodulatory molecules. This approach is based on the use of tumor-targeting moieties, like antibodies, small molecules, or peptides, specific to tumor-associated antigens that, through the use of suitable linkers, are able to release the payload only at the tissue of interest. In this work, we focused on the use of small molecules as targeting vectors, which, thanks to their reduced size, are characterized by rapid extravasation, homogenous uptake in antigen-positive tissues, and a very low risk of immunogenicity. Fibroblast Activation Protein (FAP) is a tumor-associated antigen overexpressed in the vast majority of solid human malignancies while virtually absent in healthy tissues, making it an attractive target for targeting delivery approaches. OncoFAP is a small organic FAP ligand with ultra-high affinity and has already demonstrated exquisite tumor accumulation in human patients. OncoFAP has been employed for the selective delivery of radionuclides and cytotoxic drugs to tumor lesions showing strong tumor accumulation and therapeutic benefit in tumor-bearing mice. OncoFAP-GlyPro-MMAE (Small Molecule-Drug Conjugate, SMDC) and 177Lu-OncoFAP-23 (Radioligand Therapeutic, RLT) represent our most advanced OncoFAP derivatives. In particular, OncoFAP-GlyPro-MMAE features the FAP cleavable linker Glycine-Proline, allowing for the selective release of Monomethyl Auristatin E (MMAE) only in the tumor microenvironment. Treatment with OncoFAP-GlyPro-MMAE mediated a potent and long-lasting anti-cancer activity in tumor-bearing mice. Our OncoFAP-GlyPro construct is designed to provide two levels of tumor selectivity. First, the compound selectively accumulates to FAP-positive cancer lesions thanks to the interaction of FAP with the inhibitor OncoFAP. Second, the OncoFAP moiety slowly unbinds, allowing the glycine-proline linker to be cleaved by the enzymatic activity of FAP, resulting in the release of the cytotoxic cargo. To study the design of our FAP-targeted SMDCs, we first investigated the use of payloads with a different structure or mechanism of action from MMAE, focusing on cytotoxic molecules already employed in the last generation of approved Antibody Drug Conjugates (ADCs) such as Topoisomerase I inhibitors (e.g., SN-38, Exatecan, and DXd) or other MMAE derivatives (e.g., MMAF). Furthermore, we evaluated the impact of stronger FAP inhibitors as targeting moieties in our SMDCs to tune the release kinetics of the drug at the tumor site. To maximize the therapeutic performances of our best-in-class RLT and SMDC, we combined them with tumor-targeted immunocytokines able to trigger an immune response directed against the tumor. A therapy experiment in immunocompetent mice bearing FAP-positive tumors showed that the combination with immunotherapy elicits a synergic and robust anti-tumor activity. Finally, we evaluated the use of immunostimulatory drugs as payloads in OncoFAP-based conjugates. The delivery of immunostimulants to the tumor enables the activation and direction of the immune system against cancer cells. Through a screening of known compounds and medicinal chemistry efforts to discover new active molecules, we developed novel conjugates able to mediate a potent and long-lasting anti-tumor effect in mice bearing fast-growing tumors.

Farmaci chemioterapici convenzionali rappresentano il trattamento di scelta per una vasta varietà di tumori solidi e ematologici. Tuttavia, la maggior parte di questi farmaci non è in grado di localizzarsi selettivamente al tumore causando gravi effetti avversi. Una strategia di successo è rappresentata dalla veicolazione mirata che consente l’accumulo selettivo al sito di interesse di diverse molecole con attività terapeutica come farmaci citotossici, radionuclidi e immunomodulatori. L’approccio si basa sull’utilizzo di vettori mirati al tumore, come anticorpi, piccole molecole oganiche o peptidi, specifici per antigeni tumorali, che, attraverso l’utilizzo di linker adatti, sono capaci di rilasciare il payload solo nel tessuto di interesse. In questo lavoro ci siamo concentrati sull’uso di piccole molecole come vettori veicolanti, le quali, grazie alla loro dimensione ridotta, sono caratterizzate da rapida capacità di diffusione, accumulo omogeneo nei tessuti positivi all’antigene, e un basso rischio di immunogenicità. Fibroblast Activation Protein (FAP) è un antigene tumorale sovraespresso nella maggior parte dei tumori solidi con una espressione molto bassa in tessuti sani, rendendolo un bersaglio attraente per gli approcci di veicolazione mirata. OncoFAP è un piccolo ligando organico di FAP con elevata affinità e ha dimostrato un accumulo tumorale eccellente in pazienti umani. OncoFAP è stato utilizzato per il trasporto selettivo di radionuclidi e farmaci citotossici alle lesioni tumorali dimostrando un elevato accumulo tumorale e benefici terapeutici in modelli preclinici. OncoFAP-GlyPro-MMAE (Small Molecule-Drug Conjugate, SMDC) e 177Lu-OncoFAP-23 (Radioligand Therapeutic, RLT) rappresentano i nostri derivati di OncoFAP in stato più avanzato. In particolare, OncoFAP-GlyPro-MMAE presenta il linker Glicina-Prolina suscettibile a FAP il quale permette il rilascio selettivo di Monomethyl Auristatin E (MMAE) solo nel microambiente tumorale. Il trattamento con OncoFAP-GlyPro-MMAE ha mediato un’attività antitumorale potente e duratura in topi con tumore. Il nostro costrutto OncoFAP-GlyPro è disegnato per fornire due livelli di selettività tumorale. Inizialmente, il composto si accumula selettivamente alle lesioni tumorali positive a FAP grazie all’interazione tra FAP e l’inibitore OncoFAP. In secondo luogo, la parte di OncoFAP si distacca lentamente permettendo il taglio del linker glicina-prolina grazie all’attività enzimatica di FAP, risultando nel rilascio del citotossico. Per studiare il design dei nostri SMDCs, abbiamo inizialmente investigato l’utilizzo di payload con strutture o meccanismo d’azione differente da MMAE, concentrandoci su molecole citotossiche già utilizzate nell’ultima generazione di Antibody Drug Conjugates (ADCs) approvati, come inibitori della Topoisomerasi I o altri derivati di MMAE. Inoltre, abbiamo valutato l’impatto di inibitori più potenti di FAP come targeting moieties nei nostri SMDCs per modulare la cinetica di rilascio del farmaco al sito tumorale. Per massimizzare la performance terapeutica dei nostri migliori RLT e SMDC, li abbiamo combinati con immunocitochine mirate al tumore in grado di scatenare una risposta immunitaria diretta contro il tumore. Il trattamento di topi immunocompetenti con tumori ha dimostrato che la combinazione con l’immunoterapia provoca una sinergica e robusta risposta anti-tumorale. Infine, abbiamo valutato l’uso di farmaci immunostimolatori come payload. Il trasporto di immunostimolanti al tumore permette l’attivazione e direzionamento del sistema immunitario contro il tumore stesso. Grazie ad uno screening di composti conosciuti e campagne di chimica farmaceutica per scoprire nuove molecole attive, abbiamo sviluppato nuovi coniugati capaci di mediare un effetto anti-tumorale e potente in modelli preclinici.