Impiego della tecnologia delle librerie chimiche codificate dal DNA (DELs) per l'identificazione di ligandi selettivi per PSMA, finalizzati alla terapia mirata del cancro alla prostata metastatico

DNA-encoded chemical libraries (DELs) are a drug discovery technology affirming its applicability in the identification and affinity maturation of tumor-associated antigens’ ligands. Prostate-Specific Membrane Antigen (PSMA) is a tumor-associated antigen overexpressed in metastatic prostate cancer cells membranes. In metastatic diseases, standard treatments are ineffective, to cover this unmet medical need, PSMA-targeting radioligands have recently arisen as promising PSMA-positive prostate cancer therapeutics. Among those, PluvictoTM stood out as the first FDA approved PSMA-targeting RLT however, its therapeutic window is narrowed by the unwanted drug accumulation in healthy salivary glands and kidney, representing the main limiting aspect of its use in prostate cancer therapy. In this thesis, we first investigated the mechanism behind the undesired healthy organs uptake of PluvictoTM. We proposed that the expression of Glutamate Carboxy Peptidase III (GCPIII, a PSMA-isozyme) is the principal responsible for the off-target accumulation of PSMA-targeted drugs in salivary glands and kidney. We analyzed the PSMA sequence against the human proteome to point out proteins closely related to the target. Glutamate carboxypeptidase III (GCPIII), N-acetylated alpha-linked acidic dipeptidase like 1 (NAALADL-1), and transferrin receptor 1 (TfR1) were spotted as extracellular targets with the highest similarity to PSMA. Fluorescence polarization experiments revealed a significant affinity of a fluorescent derivative of PluvictoTM for GCPIII and PSMA, while the other two enzymes did not interact with the compound of interest. Additionally, immunofluorescence was applied to assess GCPIII expression in human salivary glands and kidneys, parallelly using commercially available specific antibodies. The analysis confirmed the presence of GCPIII in healthy human salivary glands and kidney tissues, corroborating the proposed off-target accumulation mechanism of PluvictoTM and related Glu-ureido PSMA radiopharmaceuticals. The following project was initiated with the goal of enhancing the selectivity of PSMA-targeting radioligand therapeutics (RLTs), to address the issue of unintended accumulation in healthy tissues. In this work, DNA-encoded chemical library (DEL) technology was used for the optimization of nanomolar and sub-nanomolar PSMA ligands, to improve both their affinity and selectivity for PSMA over GCPIII. In the thesis, I describe the synthesis of affinity and selectivity maturation DNA-encoded chemical libraries (ASM-DELs) comprising 18’284’658 molecules. By conducting parallel screenings of our libraries against both PSMA and GCPIII, we isolated PSMA HITs which displayed low enrichment in GCPIII selections. Among these, compound A70-B104-HIT3 emerged as the most potent and selective PSMA ligand. This compound showed strong binding and successful internalization in PSMA-positive cancer cells, as proved by flow cytometry and confocal microscopy. In vivo studies in tumor-bearing mice using a lutetium-177-labeled derivative of compound A70-B104-HIT3 exhibited selective accumulation in PSMA-expressing tumors, with a tumor uptake of approximately 7.4% ID/g, 2 hours post-administration. Furthermore, the ligand showed preferential targeting of cancer lesions against human salivary glands by autoradiography experiments, unlike Pluvicto™, that clearly stained both tissues. Collectively, this thesis wants to highlight that (i) PSMA is a validated antigen for tumor-targeting however, PSMA RLTs need to be optimized to avoid undesired accumulation and to minimize occurrence of side effects, that could be probably due to interaction of RLTs with the anti-target GCPIII. (ii) DEL technology is a valid tool to mature the affinity of small organic ligands for tumor-targeting purposes, meanwhile, the technology can also be used for maturation of ligand selectivity.

La tecnologia delle librerie chimiche codificate dal DNA (DEL) è una metodica di drug discovery che sta trovando crescente applicazione nell'identificazione e maturazione di ligandi ad alta affinità per antigeni tumorali. Il Prostate-Specific Membrane Antigen (PSMA) è un antigene tumore-associato sovraespresso nel cancro alla prostata metastatico, poco responsivo ai trattamenti convenzionali. Ciò ha portato allo sviluppo ed approvazione da parte di FDA del primo radioligando a scopo terapeutico diretto verso il PSMA, Pluvicto™. Tuttavia, la finestra terapeutica di Pluvicto™ è limitata dall'accumulo indesiderato del farmaco nelle ghiandole salivari e nei reni. In questa tesi, abbiamo indagato il meccanismo alla base dell'assorbimento di Pluvicto™ negli organi sani. Si è ipotizzato che l'espressione della Glutammato Carbossipeptidasi III (GCPIII, un isoenzima del PSMA) sia la principale responsabile dell'accumulo “off-target” dei farmaci mirati al PSMA nelle ghiandole salivari e nei reni. La sequenza di PSMA è stata analizzata rispetto al proteoma umano per individuare le proteine con più elevata similarità verso il target, tra queste: la Glutammato Carbossipeptidasi III (GCPIII), la N-acetilata alfa-linked acidic dipeptidase like 1 (NAALADL-1) e il recettore della transferrina 1 (TfR1). Gli esperimenti di polarizzazione della fluorescenza hanno dimostrato che un derivato fluorescente di Pluvicto™ possiede un’alta affinità sia per GCPIII che per PSMA, mentre nessuna interazione con gli altri due enzimi è stata rilevata. In aggiunta, esperimenti di immunofluorescenza sono stati svolti per valutare l'espressione di GCPIII nelle ghiandole salivari e nei reni umani, utilizzando anticorpi specifici disponibili in commercio. L'analisi ha confermato la presenza di GCPIII nelle ghiandole salivari e nei tessuti renali umani. L’obiettivo del successivo progetto è stato quello di migliorare la selettività delle terapie radioattive mirate al PSMA. In questo lavoro, è stata utilizzata la tecnologia DEL per l'ottimizzazione di ligandi di PSMA con costanti di dissociazione nanomolari e sub-nanomolari, al fine di migliorarne sia l’affinità che la selettività per PSMA rispetto a GCPIII. Nella tesi, descrivo la sintesi di DEL per la maturazione dell'affinità e della selettività (ASM-DELs) costituite da 18.284.658 di combinazioni finali. Attraverso screening paralleli delle nostre librerie contro PSMA e GCPIII, abbiamo isolato composti HIT per PSMA che mostravano un basso arricchimento nelle selezioni di GCPIII. Tra questi, il composto A70-B104-HIT3 è emerso come il ligando PSMA più potente e selettivo. Questo composto ha dimostrato di saper legare le cellule tumorali positive al PSMA attraverso esperimenti di citometria a flusso e ha manifestato l’abilità di internalizzare nelle suddette cellule nelle analisi di microscopia confocale. Il derivato del composto A70-B104-HIT3 marcato con lutetio-177 è stato testato in vivo su topi e ha evidenziato un accumulo selettivo nei tumori che esprimono l’antigene PSMA (accumulo del 7,4% ID/g nel tumore, 2 ore dopo somministrazione). Inoltre, il ligando ha mostrato un targeting preferenziale delle lesioni cancerose rispetto alle ghiandole salivari umane negli esperimenti di autoradiografia, a differenza di Pluvicto™, che ha mostrato chiaramente colorazione in entrambi i tessuti. Nel complesso, questa tesi vuole sottolineare che (i) il PSMA è un antigene validato per il targeting tumorale; tuttavia, i ligandi radio marcati mirati al PSMA devono essere ottimizzati per ridurne l’accumulo indesiderato e minimizzare l'insorgenza di effetti collaterali, probabilmente dovuti all'interazione dei RLT con l'anti-target GCPIII. (ii) La tecnologia DEL è uno strumento valido per maturare l'affinità dei ligandi organici verso target tumorali e il suo uso può anche essere esteso alla maturazione della loro selettività.