Caratterizzazione del fenotipo scheletrico adulto in un modello murino della displasia diastrofica

Diastrophic dysplasia (DTD) is a recessive chondrodysplasia caused by mutations in the SLC26A2 gene encoding for a sulfate/chloride antiporter. SLC26A2 impairment leads to low intracellular sulfate level causing proteoglycan under sulfation and alterations of cartilage extracellular matrix properties. In the patients, degenerative changes in the joints are progressive and accentuated with growth and age; joint deformities and premature osteoarthritis are the rule in DTD patients. To better characterize the bone and joint structure of DTD and to develop therapeutical approaches, a Slc26a2 knock-in mouse (dtd mouse) was generated and the phenotype during skeletal growth was studied. Since DTD is progressive, in this work we investigated skeletal alterations in adult dtd mice of both genders at 1, 2 and 6 months of age. This approach can be useful for the assessment of therapeutic endpoints for potential new treatments and to delve deeper into the etiology of DTD clinical manifestations, including OA, a widespread condition in the general population whose complex and multifactorial pathogenesis still needs to be clarified. X-ray studies confirmed that dtd mice are characterized by a skeletal phenotype with significant growth retardation e reduced bone measurements over controls at all the time points. The evaluation of bone quality and architecture through dual-energy X-ray absorptiometry (DEXA) and micro-computed tomography (micro-CT) demonstrated that bone mineral content and density alongside the trabecular and cortical bone parameters are altered in dtd compared with non-mutant mice for all age groups. To assess joint degeneration, micro-CT focused on the subchondral bone trabeculae, which demonstrated depletion over time in both male and female dtd mice. Since articular cartilage (AC) and subchondral bone are closely related, mutually influencing their homeostasis, a histological analysis of the AC was performed to evaluate cartilage damage. Safranin-O staining and OARSI scoring identified AC impairment in dtd mice of both sexes over time, characterized by reduced PG staining, loss of the tidemark, early-stage cartilage lesions, and, in the most severe cases, bone exposure. Notably, histological analysis also revealed an increased number of ghost adipocytes in the tibia and femur epiphyses of dtd mice, particularly at 1 and 2 months of age. This finding was confirmed by Perilipin-1 immunostaining, which allowed for the identification and quantification of adipocytes. Since adipocytes, chondrocytes, and osteoblasts differentiate from mesenchymal stem cells (MSCs), the observed AC impairment might be due to disrupted cell differentiation within the joint, thereby impacting on its homeostasis and contributing to cartilage damage. An additional factor potentially promoting AC degeneration could be alterations in the ECM macromolecules. Immunohistochemical staining for aggrecan and decorin, two key ECM components, revealed reduced content and altered distribution within the AC of dtd mice. Furthermore, Picrosirius Red staining highlighted an abnormal collagen network in both the AC and subchondral bone trabeculae. Taken together, these alterations in ECM composition could lead to disruptions in the biomechanical properties of the ECM, further compromising joint homeostasis. Overall, these results confirmed the presence of cartilage and bone impairment in adult dtd mice and demonstrated that the skeletal degeneration is progressive as it occurs in DTD patients.

La displasia diastrofica (DTD) è una rara condrodisplasia recessiva causata da mutazioni nel gene SLC26A2 che codifica per un antiporto solfato/cloruro. Mutazioni nel gene SLC26A2 causano ridotti livelli di solfato intracellulare, portando ad una sottosolfatazione dei proteoglicani (PG) e ad alterazioni delle proprietà dell'ECM cartilaginea. I pazienti sono caratterizzati da degenerazione articolare progressiva, che può causare l’insorgenza di un danno cartilagineo precoce e la sua evoluzione in osteoartrite (OA). Per elucidare i meccanismi molecolari alla base della DTD e sviluppare nuovi approcci terapeutici, è stato generato e validato un modello murino (dtd) che riproduce il fenotipo scheletrico dei pazienti affetti. Poiché la DTD è progressiva, abbiamo analizzato il fenotipo scheletrico e la degenerazione articolare di topi dtd adulti di entrambi i sessi a 1, 2 e 6 mesi di età. Questo approccio può essere utile per la valutazione degli endpoint terapeutici e per approfondire l'eziologia delle manifestazioni cliniche della DTD, inclusa l’OA, una condizione diffusa nella popolazione generale la cui patogenesi deve ancora essere chiarita. L'analisi morfometrica ha dimostrato che i topi dtd presentano un fenotipo scheletrico caratterizzato da ritardo significativo della crescita e da misurazioni ossee ridotte rispetto ai controlli a tutte le età. La valutazione della qualità e dell'architettura ossea mediante Dual Energy X-ray Absorptiometry (DEXA) e microtomografia computerizzata (micro-CT) ha dimostrato che il contenuto (BMC) e la densità minerale ossea (BMD) e i parametri del compartimento trabecolare e corticale della tibia sono alterati nei topi dtd rispetto ai topi wt a tutte le età. Per valutare possibili alterazioni a livello articolare, è stata operata un’analisi micro-CT sulle trabecole ossee subcondrali, che hanno mostrato una deplezione nei topi dtd di entrambi i sessi. Poiché la cartilagine articolare (CA) e l'osso subcondrale sono strettamente correlati, è stata eseguita un'analisi istologica della cartilagine articolare per valutare la presenza di un eventuale danno cartilagineo. La colorazione con Safranina-O e l’OARSI (Osteoarthritis Research Society International) score hanno evidenziato alterazioni a carico della cartilagine articolare nei topi dtd di entrambi i sessi, caratterizzata da una ridotta colorazione dei PG, perdita del tidemark, lesioni focali e, nei casi più gravi, esposizione dell’osso sottostante. L’analisi istologica e immunoistochimica tramite perilipina-1 ha mostrato anche un aumentato del numero di adipociti fantasma nelle epifisi di tibia e femore dei topi dtd, in particolare a 1 e 2 mesi di età. Poiché adipociti, condrociti e osteoblasti derivano dalle cellule staminali mesenchimali (MSCs), il danno cartilagineo osservato potrebbe essere dovuto a un’alterazione nel differenziamento cellulare all'interno dell'articolazione, contribuendo alla degenerazione cartilaginea. Un ulteriore fattore predisponente la degenerazione della cartilagine articolare è rappresentato da alterazioni nelle macromolecole dell’ECM. L’ analisi immunoistochimica di aggrecano e decorina, ha mostrato una ridotta quantità e un’alterata distribuzione di questi due PG all'interno della cartilagine articolare nei topi dtd. Inoltre, la colorazione con Picrosirius Red ha messo in evidenza anomalie nel network collagenico sia nella cartilagine articolare che nelle trabecole ossee subcondrali. Complessivamente, queste alterazioni nella composizione della matrice potrebbero portare ad un’alterazione delle sue proprietà biomeccaniche, compromettendo ulteriormente l'omeostasi articolare. Nel complesso, questi risultati hanno confermato la presenza di danno cartilagineo e alterazioni nella qualità ossea nei topi dtd adulti e hanno dimostrato che la degenerazione scheletrica è progressiva, come nei pazienti affetti da DTD.