La perdita di CHK1 contribuisce all'accumulo di danno al DNA in un modello cellulare di sclerosi laterale amiotrofica

Amyotrophic lateral sclerosis is a fatal neurodegenerative disease, with unclear causes and no effective therapy. A hallmark of ALS is the presence in affected motor neurons (MNs) of cytoplasmic inclusions (CIs) composed of misfolded proteins. Several genes have been found mutated in patients, including TARDBP that encodes for TAR DNA Binding Protein 43 kDa (TDP-43), and Fused in Sarcoma (FUS), that encodes for FUS, two DNA/RNA binding proteins with key roles in RNA metabolism. TDP-43 is the most common component of CIs in both familial and sporadic patients. Instead, patients carrying FUS mutations show FUS CIs. Recently, TDP-43 and FUS have been found to play important roles in DNA repair. Consistent with this finding, loss of genome integrity has been observed in ALS patients. Our group found that, upon DSB generation, non-coding RNAs, termed damage-induced long non-coding RNAs (dilncRNAs) are transcribed by RNA polymerase II from broken DNA ends and are then processed by DROSHA and DICER to generate shorter DNA Damage response RNAs (DDRNAs). dilncRNAs and DDRNAs are important to stimulate the recruitment of key DNA repair factors to DSBs. TDP-43 and FUS are both interactors of DROSHA and DICER and stimulate their processing activity on target RNAs, suggesting that they may also stimulate DDRNA biogenesis. In this study, using a cellular model system of ALS, I investigated the effects of TDP-43 and FUS CIs on DSB signalling and repair. I found that transient overexpression of wild-type (WT) TDP-43 and mutant FUS P525L resulted in formation of CIs in a subset of cells. Additionally, I found that the presence of CIs correlated with accumulation of γH2AX, a common marker of DNA damage. Interestingly, CI-bearing cells exhibit an aberrantly increased activation of phosphorylated Ataxia Telangiectasia Mutated (pATM), the apical DNA Damage Response (DDR) kinase, in the absence of experimentally provided DNA damage. Cells bearing CIs also show a defective DDR signalling, with defective recruitment of pATM, as well as DNA repair factor p53 Binding Protein (53BP1) and DNA damage-induced mono- and polyubiquitin chromatin modifications. Moreover, I found that DROSHA protein levels and dilncRNAs levels were reduced in cells with CIs. Similarly, the DDR kinase Checkpoint Kinase 1 (CHK1) and the histone chaperone Anti-Silencing Function 1A (ASF1A) proteins, recently implicated in DSB repair in non-dividing cells and neuronal survival, are downregulated in cells bearing CIs. Importantly, primary fibroblasts derived from a patient carrying the TDP-43 A382T mutation, motor neuron progenitors (MNPs) derived from a sporadic ALS patient and murine motor neuron derived from animals carrying the P517L Fus mutation, equivalent to the human P525L FUS mutation also show accumulation of DNA damage. I also detected reduced levels of DROSHA and CHK1 proteins in sALS MNPs. Transient overexpression of CHK1 and ASF1A was sufficient to reduce γH2AX accumulation by rescuing DDR defects in cells bearing FUS CIs. In contrast, overexpression of CHK1 in cells bearing TDP-43 CIs reduced γH2AX accumulation but did not rescue DDR defects. Instead, ASF1A overexpression in cells bearing TDP-43 CIs had no effect neither on γH2AX accumulation nor on rescuing DDR defects. I determined that formation of FUS CIs causes CHK1 degradation via the proteasome. Finally, a FUS-ALS mouse model shows increased levels of γH2AX and reduced levels of 53BP1 foci, as well as reduced CHK1 protein levels. Thus, I propose a model in which formation of TDP-43 and FUS CIs causes reduced level of specific DDR-related factors, including CHK1 and ASF1A, which in turn leads to defective DSB repair. This in turn causes DSB accumulation and chronic and aberrant DDR activation, possibly leading to neuronal cell death and neurodegeneration.

La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è una malattia neurodegenerativa fatale, con cause non chiare e nessuna terapia disponibile, caratterizzata dalla presenza di inclusioni citoplasmatiche (CIs) composte da proteine misfoldate. Diverse mutazioni in diversi geni sono state identificate, tra cui TARDBP e FUS, codificanti per le DNA/RNA binding proteins TAR DNA-Binding Protein 43 kDa (TDP-43) e Fused in Sarcoma (FUS), rispettivamente, con importanti ruoli nel metabolismo dell’RNA. TDP-43 è il componente più frequente delle CIs sia nei casi familiari sia in quelli sporadici. Nei pazienti con mutazioni nel gene FUS, le CIs sono composte da FUS. Recentemente, TDP-43 e FUS sono stati implicati nel riparo del DNA. In accordo con questa osservazione, accumulo di danno al DNA è stato osservato nei pazienti. Il nostro gruppo ha scoperto che, quando si genera una rottura del DNA a doppio filamento (DSB), RNA non codificanti chiamati damage-induced long non-coding RNAs (dilncRNAs) sono trascritti dall’RNA polimerasi II dalle estremità di DNA danneggiate e processati da DROSHA e DICER in specie più corte, chiamate DNA Damage response RNAs (DDRNAs), necessari per il reclutamento i fattori di riparo ai siti di danno. TDP-43 e FUS sono stati identificati come interattori di DROSHA e DICER, stimolando il processamento degli RNA target, suggerendo che TDP-43 e FUS svolgano un’importante funzione nella biogenesi dei DDRNAs. L’overespressione transiente di TDP-43 wild-type (TDP-43 WT) e la forma mutata di FUS (FUS P525L) causano la formazione di CIs in una porzione di cellule. Ho osservato che la presenza di CIs è associata all’accumulo di γH2AX, un noto marker di danno al DNA. Inoltre, le cellule con CIs mostrano un’aumentata attivazione della chinasi della risposta al danno al DNA (Ataxia Telangiectasia Mutated, ATM) anche in assenza di agenti genotossici. Inoltre, le cellule con CIs non sono in grado di rispondere correttamente a danno al DNA esogeno, mostrando l’assenza di reclutamento di ATM stessa ai siti di danno, così come quello di p53 Binding Protein (53BP1) e l’ubiquitinazione della cromatina in seguito alla formazione di DSBs. Durante il mio Progetto ho anche scoperto che i livelli di DROSHA e quelli dei dilncRNAs sono ridotti in cellule con CIs. Ho scoperto che anche i livelli della chinasi della risposta al danno al DNA Checkpoint Kinase 1 (CHK1) e dell’istone chaperone ASF1A, importanti per il riparo dei DSB in cellule non-proliferanti e per la sopravvivenza dei neuroni, sono ridotti nelle cellule con CIs. Fibroblasti primari derivanti da un paziente con la mutazione A382T in TDP-43, progenitori di motoneuroni (MNPs) derivanti da un paziente sporadico e in motoneuroni derivati da topi portatori della mutazione di Fus P517L, equivalente alla mutazione FUS P525L umana mostrano un accumulo di danno al DNA. Inoltre, nei MNPs derivati dal paziente sporadico ho osservato anche una riduzione dei livelli proteici di DROSHA e CHK1. L’overespressione transiente di CHK1 e ASF1A in cellule con CIs di FUS è sufficiente per ridurre l’accumulo di yH2AX e ripristinare una risposta al danno corretta. In cellule con CIs di TDP-43, il ripristino dei livelli di CHK1 è sufficiente per ridurre l’accumulo di γH2AX ma non per ripristinare una corretta attivazione della risposta al danno al DNA mentre l’overespressione di ASF1A non ha effetto né sull’accumulo di γH2AX né sulla corretta attivazione della risposta al danno al DNA. La formazione di CIs di FUS induce la degradazione di CHK1 attraverso il proteasoma. In un modello murino di FUS-SLA ho osservato aumentati livelli di yH2AX e ridotti livelli di 53BP1 e CHK1. Nel mio modello, la formazione delle CIs di TDP-43 e FUS causa la riduzione dei livelli di diversi fattori di riparo del DNA, inclusi CHK1 e ASF1A, impendendo la risoluzione dei DSBs e inducendo un’attivazione cronica e aberrante della risposta al danno al DNA e portando a morte neuronale.