THE IMPACT OF WATERLOGGING, DROUGHT, SALINITY AND MULTIPLE ABIOTIC STRESSES ON ARABIDOPSIS THALIANA: A COMPREHENSIVE PHENOTYPING AND MATABOLOMIC ANALYSIS

Ensuring food security is one of the main challenges associated with global population growth under changing climate conditions. The increase in soil salinity levels, waterlogging, drought, heat waves, and delayed cooling pose serious threats to crops, often occurring simultaneously in the field. This study aims to deepen our understanding of the impact of single and combined abiotic stresses on growth, biochemical, and photosynthetic responses in Arabidopsis thaliana (L.), investigating both individual and combined stress conditions. The results of drought, salinity, heat, and cold stress indicate that the lowest QY_max values were recorded in plants subjected to salinity stress. NPQ increased under both single and combined heat and salinity stress, while qP decreased under combined stress conditions. Consistently, MDA and H₂O₂ levels were altered across all stress conditions, with the highest values observed under salinity stress alone and in combination. Targeted metabolomic quantification of glycine and GABA revealed no significant changes under stress, whereas proline exhibited a hierarchically stronger impact under salinity stress, and glycine betaine primarily decreased under drought combinations. Untargeted metabolomics coupled with multivariate statistical analysis highlighted distinct metabolic reprogramming in response to different stress conditions, differentiating the impact of salinity, drought, and their combinations with heat and cold. Pathway analysis revealed significant effects of abiotic stress on hormones, amino acids and derivatives, and secondary metabolites. Flavonoids accumulated predominantly under drought stress alone and in combination with heat and cold, while nitrogen-containing compounds decreased across all combined stress treatments. These findings enhance our understanding of the impact of various stress combinations, hierarchically distinguishing specific stress effects and emphasizing the importance of studying stress interactions. Sudden torrential rains, subsequent waterlogging, increased soil salinity levels, heat waves, and delayed cooling severely threaten crops, often occurring simultaneously. Our study reports the physiological and metabolomic changes in Arabidopsis thaliana (L.) after three days of exposure to waterlogging alone and in combination with cold, heat, and salinity. Our results confirm that the co-occurrence of multiple stresses does not act as a mere sum of individual stress effects but rather represents a novel stress condition with unique impacts on plant biochemical signatures. ROS production and targeted quantification of stress markers (glutathione, GABA, proline, and glycine) in leaves and roots consistently revealed the strongest impact of waterlogging and its combinations on plant biochemistry. Untargeted metabolomics and multivariate statistics identified distinct metabolic reprogramming across different single and combined stress conditions, distinguishing the effects of waterlogging combined with cold, heat, and salinity. Several classes of secondary metabolites were specifically modulated in different tissues, involving terpenes, sterols, flavonoids, and amino acid derivatives in leaves, as well as flavonoids, amino acid derivatives, alkaloids, and fatty acids in roots. These findings contribute to understanding the hierarchical impact of various stresses and their combinations, highlighting their specific effects and interactions. In particular, beyond the impairment of aerial plant parts, the root system is highly vulnerable to these stress factors, affecting plant growth and survival. In our study, we integrated metabolomics and metagenomics to unveil the response of Arabidopsis thaliana (L.) following exposure to cold, heat, salinity, and waterlogging—both individually and in combination—for three days. We examined metabolic changes in roots and root exudates, as well as the structure and diversity of rhizosphere microorganisms. Finally, a mixomics data integration approach provided further insights into their interactions. In roots, waterlogging exerted the strongest impact on metabolism compared to other individual stresses, leading to a downregulation of flavonoids, amino acid derivatives, alkaloids, and fatty acids. When combined with thermal stresses, an additive and synergistic effect was observed. Regarding root exudates, flavonoids, terpenoids, and alkaloids were the main compound classes affected. While cold and heat stress alone promoted accumulation, waterlogging led to a decrease, with mixed trends observed under combined waterlogging stress. Notably, salinity alone and in combination with waterlogging resulted in a specific modulation of stress responses. Although alpha and beta diversity of microbial communities remained stable, suggesting resilience to short-term stress, the modulation of specific taxa was recorded under each stress condition. Overall, these findings enhance our understanding of the hierarchical impact of various stress combinations, highlighting their specific effects and interactions at the rhizosphere level.

Garantire la sicurezza alimentare è una delle principali sfide legate alla crescita della popolazione mondiale in condizioni di cambiamento climatico. L'aumento dei livelli di salinità del suolo, i ristagni d'acqua, la siccità, le ondate di calore e il raffreddamento tardivo minacciano gravemente le colture e spesso, in campo, si verificano congiuntamente. Questo lavoro si propone di approfondire l'impatto degli stress abiotici singoli e combinati a livello di crescita, biochimico e fotosintetico in Arabidopsis thaliana (l.) studiando gli stress singoli e combinati. I risultati della siccità, della salinità, del caldo e del freddo mostrano che i valori più bassi di QY max sono stati registrati nelle piante sottoposte a stress da salinità, il NPQ è aumentato in caso di stress da calore e salinità singoli e combinati, mentre il qP è diminuito in caso di stress combinato. Coerentemente, il contenuto di MDA e H2O2 è risultato alterato in tutte le condizioni di stress, ma i valori più elevati sono stati registrati con la sola salinità e in combinazione. La quantificazione metabolomica targeted di glicina e GABA ha indicato che questi osmoliti non sono cambiati significativamente sotto stress, la prolina ha invece evidenziato un impatto gerarchicamente più forte della salinità, mentre la glicina-betaina si è ridotta principalmente nelle combinazioni di siccità. La metabolomica untargeted accoppiata alla statistica multivariata ha evidenziato una riprogrammazione metabolica distinta in relazione alle diverse condizioni di stress, singoli o in combinazione, differenziando l'impatto della salinità, della siccità e della loro combinazione con freddo e caldo. L'analisi dei patway ha rivelato che gli stress abiotici hanno influenzato in modo significativo gli ormoni, gli aminoacidi e i derivati e i metaboliti secondari. I flavonoidi si sono accumulati maggiormente con la siccità applicata da sola e in combinazione con il caldo e il freddo, mentre i composti contenenti N sono diminuiti con tutti i trattamenti di stress combinati. Questi risultati contribuiscono ad approfondire l'impatto di varie combinazioni di stress, evidenziando gerarchicamente gli effetti specifici dello stress e sottolineando l’importanza dello studio delle combinazioni. Le piogge torrenziali improvvise, il successivo ristagno d'acqua, l'aumento dei livelli di salinità del suolo, le ondate di calore e il raffreddamento ritardato minacciano gravemente le colture e spesso si verificano simultaneamente. il nostro lavoro riporta i cambiamenti fisiologici e metabolomici di Arabidopsis thaliana L. dopo un'esposizione di 3 giorni al solo ristagno d'acqua e alla combinazione di freddo, calore e salinità. I nostri risultati hanno confermato che la compresenza di diversi stress non agisce come la somma dei singoli stress, ma rappresenta piuttosto una nuova condizione di stress con effetti unici sulle firme biochimiche della pianta. La produzione di ROS e la quantificazione targeted dei marcatori di stress (glutatione, GABA, prolina e glicina) nelle foglie e nelle radici hanno rivelato in modo coerente il maggiore impatto del ristagno idrico e delle sue combinazioni sulla biochimica delle piante. La metabolomica untargeted e la statistica multivariata hanno rivelato una riprogrammazione metabolica distinta nelle diverse condizioni di stress, singole o combinate, distinguendo l'impatto del ristagno idrico combinato con il freddo, il caldo e la salinità. Diverse classi di metaboliti secondari sono state modulate in modo specifico per ogni tessuto, coinvolgendo terpeni, steroli, flavonoidi e derivati degli aminoacidi nelle foglie e flavonoidi, derivati degli aminoacidi, alcaloidi e acidi grassi nelle radici. Questi risultati contribuiscono a comprendere l'impatto gerarchico di vari stress e delle loro combinazioni, sottolineando gli effetti specifici degli stress e le loro interazioni. In particolare, oltre alla compromissione delle parti aeree delle piante, l'apparato radicale è particolarmente vulnerabile a questi fattori di stress, con conseguenze sulla crescita e sulla sopravvivenza della pianta. Nel nostro studio, abbiamo combinato la metabolomica e la metagenomica per svelare la risposta di Arabidopsis thaliana l. in seguito all'esposizione al freddo, al caldo, al sale e al ristagno idrico e alla loro combinazione per tre giorni, esaminando i cambiamenti metabolici nelle radici e negli essudati radicali, nonché la struttura e la diversità dei microrganismi della rizosfera. Infine, l'approccio di integrazione dei dati di mixomics ha permesso di approfondire le loro interazioni. Nelle radici, il ristagno d'acqua ha influenzato fortemente il metabolismo rispetto ad altri singoli stress, con una modulazione verso il basso di flavonoidi, derivati degli aminoacidi, alcaloidi e acidi grassi, mostrando un effetto additivo e sinergico quando combinato con gli stress termici rispettivamente. Per quanto riguarda gli essudati radicali, i flavonoidi, i terpenoidi e gli alcaloidi sono stati le principali classi di composti interessate. mentre gli stress da freddo e da caldo da soli hanno indotto un aumento dell'accumulo, il ristagno idrico ha provocato un abbassamento dell'accumulo e sono state osservate tendenze miste negli stress combinati con il ristagno idrico. In particolare, la salinità da sola e la sua combinazione con il ristagno idrico hanno portato a una modulazione specifica dello stress. Anche se la diversità alfa e beta delle comunità microbiche è rimasta stabile, suggerendo la loro resilienza agli stress a breve termine, la modulazione di taxa specifici è stata registrata in ogni condizione di stress. Nel complesso, questi risultati contribuiscono a comprendere l'impatto gerarchico di varie combinazioni di stress, sottolineando gli effetti specifici degli stress e delle loro combinazioni a livello della rizosfera.