Towards Safe and Sustainable Nano-Antimicrobials through a Multidisciplinary Integrated Approach: Application to Two Novel Copper Oxide Nanoparticles-Enabled Case-Studies

The overuse of antibiotics and the rise of antimicrobial-resistant bacteria emphasize the need for alternative antimicrobial strategies. This PhD Thesis contributes to this effort by developing, applying, and evaluating copper oxide nanoparticles (wCuO NPs) synthesized via a sonochemical water-based method as nano-antimicrobials for enabling nano-enabled products (NEPs) in aquaculture. Aligned with the Safe and Sustainable by Design (SSbD) principles and the European Green Deal, this research also supports the AMROCE project, which focuses on antibiotic-free solutions for aquatic environments. A multidisciplinary approach was used to assess the safety and sustainability of antimicrobial wCuO NPs and two NEPs case studies (CS): antimicrobial/antibiofouling membranes for water filtration (CS1) and monofilaments for fish cage nets (CS2). These NEPs aim to mitigate biofilm formation and bacterial contamination. Design alternatives were evaluated, including polyvinyl butyral (PVB) as a binder in membranes and different extrusion speeds for monofilaments. Biological toxicity impacts of wCuO NPs and NEPs leachates were analyzed under exploitation-like conditions, focusing on aquatic ecotoxicity and human toxicity. Life Cycle Assessment (LCA) following ISO 14040-44 standards identified environmental hotspots in nanomaterial synthesis and manufacturing processes. In vivo zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae were employed to assess acute toxicity, using Fish Embryo Toxicity tests, morphometric analyses, and behavioral evaluations. In vitro studies on human transgenic keratinocytes examined skin sensitization risks from membrane leachates. Results showed that wCuO NPs delayed embryo hatching, an effect mitigated by zinc doping in ZnCuO NPs, though ZnCuO caused higher mortality. Environmental analyses highlighted wCuO NPs as more sustainable due to lower resource demands during synthesis. The NEPs demonstrated enhanced antimicrobial efficacy against S. aureus and E. coli compared to pristine materials. However, copper ion release required careful management. Both NEPs interfered with zebrafish hatching, with monofilaments showing copper ion concentration-dependent lethality. Embedding wCuO NPs in a polymeric matrix reduced skin irritation, while PVB mitigated sensitization by immobilizing NPs, preventing release into aqueous media. LCA revealed energy use as a key contributor to environmental impacts for most categories and identified other key contributors to environmental impacts, particularly the materials used in NM production (e.g., chemicals and polymer inputs). LCA highlighted the environmental costs associated with nano-enabling processes compared to conventional material production, underscoring the importance of adopting green synthesis methods, eco-friendly formulations, and alternative materials to minimize environmental risks. Integrating nano(eco)toxicity evaluations and LCA, the study introduces an innovative framework for balancing functionality, safety, and sustainability. Tools like Key Decision Factors (KDFs) and Key Performance Indicators (KPIs) were developed to guide nano-antimicrobials' design and application. Findings also informed Standard Operating Procedures (SOPs) and Material Safety Data Sheets (MSDSs), offering practical guidelines for stakeholders. By advancing wCuO NPs-enabled NEPs for aquaculture, this Thesis demonstrates how interdisciplinary research can achieve SSbD principles in nanotechnology. A major challenge remains the absence of characterization factors (CFs) specific for nanomaterials, limiting precise environmental assessments. Future work will integrate case-specific findings into existing methodological frameworks, enabling more comprehensive evaluations. These advancements will ensure that future innovations in nanotechnology prioritize safety, sustainability, and functionality while contributing to refined risk and LCA methodologies.

L'uso di antibiotici e l’aumento di batteri resistenti evidenziano la necessità di strategie antimicrobiche alternative. Questa tesi esplora l'applicazione di nanoparticelle antimicrobiche di ossido di rame (wCuO NP), sintetizzate tramite un metodo sonochimico, per sviluppare materiali nano-abilitati (NEPs) in acquacoltura, in linea con i principi Safe and Sustainable by Design (SSbD) e il Green Deal europeo, supportando il progetto europeo AMROCE. Due casi studio valutano l’uso di queste nanoparticelle in membrane per filtrazione dell’acqua (CS1) e monofilamenti per reti da allevamento (CS2), includendo alternative progettuali come l’uso di polivinilbutirrale (PVB) e diverse velocità di estrusione. Gli impatti di tossicità delle wCuO NP e dei NEPs sono stati analizzati sia a livello ecotossico che umano, mentre la valutazione del ciclo di vita (LCA, ISO 14040-44) ha identificato criticità ambientali nei processi di sintesi. Embrioni e larve di zebrafish (Danio rerio) sono stati utilizzati per test di tossicità acuta in vivo, mentre studi in vitro su cheratinociti umani hanno esaminato i rischi di sensibilizzazione cutanea. I risultati indicano che le wCuO NP rallentano la schiusa degli embrioni, un effetto mitigato dal doping con zinco, anche se le NP ZnCuO mostrano mortalità più elevata. Le wCuO NP sono risultate più sostenibili grazie a minori richieste energetiche e di materiali durante il processo di sintesi. I NEPs hanno mostrato un'elevata efficacia antimicrobica contro S. aureus ed E. coli, ma il rilascio di ioni rame richiede maggiori considerazioni. Entrambi i NEPs interferiscono con la schiusa degli embrioni, con una letalità, nel caso dei monofilamenti, legata alla concentrazione di rame. L'inclusione di wCuO NP in matrici polimeriche ha ridotto l’irritazione cutanea, mentre il PVB ha mitigato la sensibilizzazione immobilizzando le NP. LCA ha evidenziato l'uso di energia e materiali come principali contributori agli impatti ambientali, sottolineando l'importanza di metodologie più sostenibili. Questo studio integra valutazioni di nano(eco)tossicità e LCA per bilanciare funzionalità, sicurezza e sostenibilità, introducendo strumenti come Key Decision Factors (KDFs) e Key Performance Indicators (KPIs) per guidare la progettazione dei materiali. I risultati supportano la stesura di SOP e MSDS per applicazioni pratiche. Avanzando lo sviluppo di NEPs con wCuO NPs, la ricerca dimostra come un approccio interdisciplinare possa allinearsi ai principi SSbD nella nanotecnologia. Tuttavia, l'assenza di fattori di caratterizzazione specifici per i nanomateriali limita le valutazioni ambientali. Ricerche future mireranno a integrare questi risultati nelle metodologie esistenti, garantendo innovazioni nanotecnologiche che prioritizzino sicurezza, sostenibilità e funzionalità.