Generation of advanced musculoskeletal tissue models by integrating biofabrication and computational techniques

The engineerization of human tissues is a very complicated process involving several steps that are strictly connected. However, to be able to study specific mechanisms of physiological and/or pathological processes it is necessary to develop models that replicate the structural and functional properties of involved tissues. The strong crosstalk occurring among musculoskeletal tissues should be considered and the integration of multiple biological components in the same device should be achieved in order to realize reliable models. In this work, biofabrication and computational simulation techniques have been combined to optimize some phases of the whole process towards the development of advanced musculoskeletal tissue models. One possible approach of biofabrication of biological constructs consists in seeding cells on three-dimensional (3D) scaffolds that support cell proliferation and extracellular matrix (ECM) formation during the tissue development. In this case, cell seeding outcome influences all the subsequent phases. Thus, it is clear the crucial role of this step in the whole process. In chapter 2 an easy and effective approach to improve the efficiency of cell seeding performed using dynamic systems is presented. Specifically, extrusion-based 3D printing technology was applied to produce 3D scaffolds made of polymeric fibers that are characterized by a non-circular cross-sectional shape. These multilobed scaffolds were tested using an oscillating perfusion bioreactor and the number of adhered cells was compared using scaffolds characterized by standard cylindrical fibers as control. Computational fluid dynamic (CFD) simulations were performed to analyze the influence of multilobed fiber geometry on two different aspects: first, the path followed by cells flowing through the scaffold fibers was assessed to understand how the fiber shape modifies the cell trajectories; secondly, the distribution of fluid velocity and shear stress on scaffold fibers was evaluated to analyze their effect on adhered cells. The proposed multilobed approach resulted in a higher seeding efficiency on multilobed fiber scaffolds compared to circular fiber scaffolds due to a combination of fluid dynamic parameters that increased the number of cells reaching regions of the fibers more suitable for cell adhesion. As a consequence, the obtained results suggest that the reciprocal influence of geometrical and fluid dynamic features and their combined effect on cell trajectories should be considered to improve the dynamic seeding efficiency when designing scaffold architecture. The growth and differentiation of several cell types are strongly dependent on environmental stimulation induced by fluid flow and/or mechanical stimuli. Thus, several types of bioreactors have been developed aiming at recreating the physiological stimulation required to obtain proper tissue maturation. In chapter 3 the influence of fluid dynamic stimulation on bone tissue maturation is evaluated. Specifically, an extrusion-based bioprinting technology was applied to produce alginate and gelatin constructs embedding human mesenchymal stem cells (hMSCs). Bioprinted constructs were dynamically cultured using a perfusion bioreactor. The effect of flow-induced mechanical stimulation was assessed through CFD simulations, performed to evaluate the distribution of shear stress, fluid velocity and hydrostatic pressure on constructs fibers. Obtained results demonstrate that stimulating the developing constructs with adequate stimuli can improve the level of tissue maturation and promote the development of bone substitutes suitable for clinical applications. A strategy based on biofabrication to address the integration of multiple tissues is presented in chapter 4, where a novel mesoscale perfusable device was designed as a tool for the 3D bioprinting of a multi-tissue construct. Specifically, a muscle-tendon-bone interface model with a physiological architecture was bioprinted ensuring a structural and functional connection between the tissues. The optimization of the perfusable device allowed the stimulation of the bioprinted tissues with distinctive culturing conditions that can be adapted to the specific needs of involved tissues. Only recently, the need of multi-tissue models is being considered with the proper attention taking into account all the aspects involved in the engineerization of human tissues, such as architectural, structural and functional connection and proper fluid dynamic and/or mechanical stimulation of involved tissues. In this regard, the work presented in this thesis represents an important contribution towards the development of advanced models for the study of all those physio-pathological mechanisms that involve multiple tissues.

L’ingegnerizzazione di tessuti umani è un processo altamente complicato che comprende diverse fasi strettamente connesse. Tuttavia, per poter studiare meccanismi specifici alla base di processi fisiologici e/o patologici, è necessario sviluppare modelli che riproducono le proprietà strutturali e funzionali dei tessuti coinvolti. Per sviluppare modelli affidabili dovrebbe essere considerata la forte interazione che avviene tra i tessuti muscolo-scheletrici e dovrebbe essere ottenuta l’integrazione di componenti biologici multipli all’interno dello stesso dispositivo. In questo lavoro, tecniche di biofabbricazione e simulazioni computazionali sono state combinate per ottimizzare alcune fasi dell’intero processo verso lo sviluppo di modelli avanzati di tessuto muscolo-scheletrico. Un possibile approccio di biofabbricazione di costrutti biologici consiste nella semina di cellule su scaffold tridimensionali (3D) che promuovano la proliferazione cellulare e la formazione di matrice extracellulare (ECM) durante lo sviluppo del tessuto. In questo caso, l’esito della semina cellulare influenza tutte le fasi successive. Quindi, risulta chiaro il ruolo cruciale di questa fase nell’intero processo. Nel capitolo 2 viene presentato un approccio semplice ed efficace per migliorare l’efficienza di semina eseguita tramite sistemi dinamici. Nello specifico, la tecnologia del 3D printing ad estrusione è stata applicata per produrre scaffold 3D fatti di fibre polimeriche caratterizzate da una sezione non circolare. Questi scaffold multilobati sono stati testati usando un bioreattore oscillante a perfusione e il numero di cellule aderite è stato confrontato utilizzando come controllo scaffold caratterizzati da fibre cilindriche standard. Simulazioni di fluidodinamica computazionale (CFD) sono state eseguite per analizzare l’influenza della geometri delle fibre multilobate su due aspetti: in primo luogo, il percorso seguito dalle cellule che fluiscono attraverso le fibre dello scaffold è stato valutato per comprendere come la forma della fibra modifica le traiettorie cellulari; secondariamente, la distribuzione della velocità del fluido e degli sforzi di taglio sulle fibre dello scaffold è stata valutata per analizzarne l’effetto sulle cellule aderite. L’approccio presentato ha mostrato una più alta efficienza di semina negli scaffold a fibre multilobate rispetto agli scaffold a fibre circolari, dovuta alla combinazione di parametri fluidodinamici che aumentano il numero di cellule che raggiungono delle regioni della fibra più adatte all’adesione cellulare. Di conseguenza, i risultati ottenuti suggeriscono la necessità di considerare l’influenza reciproca delle caratteristiche geometriche e fluidodinamiche e il loro effetto combinato sulle traiettorie cellulari per migliorare l’efficienza di semina dinamica in fase di progettazione dell’architettura di uno scaffold. La crescita e la differenziazione di molti tipi cellulari dipendono dalla stimolazione indotta dal flusso e/o meccanica. Quindi, diversi tipi di bioreattori sono stati sviluppati per ricreare la stimolazione fisiologica richiesta per ottenere una adeguata maturazione del tessuto. Nel capitolo 3 viene valutata l’influenza della stimolazione fluidodinamica sulla maturazione di tessuto osseo. Nello specifico, la tecnologia del bioprinting ad estrusione è stata applicata per produrre costrutti di alginato e gelatina con cellule staminali mesenchimali (hMSCs). I costrutti stampati in 3D sono stati coltivati dinamicamente utilizzando un bioreattore a perfusione. L’effetto della stimolazione meccanica indotta dal flusso è stato valutato attraverso simulazioni CFD, eseguite per analizzare la distribuzione degli sforzi di taglio, della velocità del fluido e della pressione idrostatica sulle fibre del costrutto. I risultati ottenuti dimostrano che stimolando i costrutti in fase di sviluppo con stimoli adeguati è possibile migliorare il livello di maturazione del tessuto e promuovere lo sviluppo di sostituti ossei adatti ad applicazioni cliniche. Nel capitolo 4 viene presentata una strategia basata sulla biofabbricazione per l’ottenimento dell’integrazione di tessuti multipli all’interno di un dispositivo perfondibile alla mesoscala, progettato come strumento per il 3D bioprinting di costrutti multi-tessuto. Nello specifico, un modello di interfaccia muscolo-tendine-osso con un’architettura fisiologica è stato stampato in 3D assicurando una connessione strutturale e funzionale tra i tessuti. L’ottimizzazione del dispositivo perfondibile ha permesso la stimolazione dei tessuti stampati con condizioni diverse che possono essere adattate alle specifiche esigenze dei tessuti coinvolti. Solamente negli ultimi anni sta crescendo la consapevolezza della necessità di sviluppare modelli multi-tessuto considerando tutti gli aspetti implicati nel processo di ingegnerizzazione di tessuti umani, quali l’architettura, la connessione strutturale e funzionale, e la stimolazione fluidodinamica e/o meccanica adatte ai tessuti coinvolti. A tal proposito, il lavoro presentato in questa tesi rappresenta un importante contributo verso lo sviluppo di modelli avanzati per lo studio di tutti quei meccanismi fisio-patologici che coinvolgono più tessuti.