From thermal to mechanical : shedding light on novel ways to control cell fate

It is of vital importance for cells to be able to communicate with - and receive inputs from - the surrounding environment, as well as with each other in a precise and efficient way. In order to properly react to external stimuli, cells have developed advanced mechanisms of communication so that they can receive an information, transfer the message across the plasma membrane, and finally respond by producing changes within the cell. Cells are sensitive to a range of different cues, depending on the type of cell and the environment they are supposed to survive in. These stimuli include, among the others: Chemical cues that are the typical ones used by cells to communicate with one another, by releasing molecules that are then sensed by other cells' receptors; Thermal stimuli as thermoregulation is critical in many living beings, cells are sensitive to the temperature variations of the enviroment, with receptors for the heat and the cold; Electromagnetic stimuli of different kind, including light sensitivity for some specialised cells like the retina ones; Mechanical cues as the mechanical stress and stiffness of the environment are critical stimuli for a number of cellular processes, from growth to differentiation to death. The chemical way of stimulation and signalling was the subject of the earliest studies in medicine and biology, thus becoming the classical path of research for the development of ways to stimulate and control the cell fate. Large effort was put in the development and optimisation of media, factors, chemical agents and protocols to direct and affect cell growth, differentiation, migration and all biological processes. Nowadays these techniques and protocols are largely assessed, both reliable and effective, but they still have drawbacks. The most important ones are the lack of reversibility of such cues, and the poor control and precision in the spatiotemporal domain: e.g., it's impossible to target specific cell sub-population within the same in vitro culture. An improvement on these techniques would require a dynamic control of the extracellular environment, thus offering the possibility to provide precise stimuli at selected time-points in a more versatile way. As a consequence - especially in the last decades - an increasing interest and effort was put in the research field of biophysical cues, besides biochemical ones, to exploit all the spectrum of stimuli that can be sensed by different kinds of cells. Among other cues, the use of light could offer a huge improvement in control and resolution, both in the spatial and temporal domain. The last decades saw important technological advancements in the field (e.g., two-photon microscopy and laser) that paved the way for advanced ways to control cells using light, with high spatial and temporal resolution (down to < 1 μm and < 1 ms, respectively). Cell photostimulation, however, presents one huge limitation: mammalian cells do not present any specific sensitivity to light (with some exceptions, as the photoreceptors in the retina). Research has thus been mainly focused on overcoming this limitation, by employing external light absorbing elements that could act as phototransducers - converting light signals into stimulation of cell activity. A number of such systems, different in size, shape, material and working principle, has been consequently developed. In this PhD thesis work I studied different ways to obtain an effective photostimulation of living cells. The different steps of my research pathway exploit different elements among the spectra of possibilities given by the (photo)active material, the cell type and the stimulation pathway to be targeted. In particular: in chapter 2 we used an organic semiconducting polymer, namely poly(3-hexylthiophene-2,5-diyl) (P3HT), as a culturing, light-sensitive substrate to affect human adipose-derived stem cells (hASCs) fate; in chapter 3 a new biomaterial, inorganic indium selenide (InSe), was tested as a substrate, with the idea that the mix of electrical and morphological properties could affect significantly the cell biology; in chapter 4 the interest in mechanical properties of the substrate for cell stimulation (introduced in chapter 3) is further developed, from the biological study on the PIEZO1 channel, to the effective stimulation of cells with an electrically controlled swelling polymer, towards the use of azobenzene-based photodeformable substrates. The focus of this research work started on stem cells stimulation with light, and then progressively shifted towards one stimulation pathway less explored to date, that is mechanotransduction. There is a double fil rouge connecting the different chapters: light is proposed as the primary controller of stimulation in this research. This is the starting point in chapters 2 and 3, where we select the photoactive material as the first step; while in chapter 4 we solely end with the idea of using a photoactive material to photomodulate our stimulation. stem cells stimulation and fate control is also present as the motivation of most research, at least as the leading drive of the studies. Chapter 2 is directly about hASC stimulation with our materials, while the following chapters are not explicitly about stem cells; however, the mechanical stimuli coming from the environment, be them passive (like in chapter 3 for the morphology) or active (like all we achieved in chapter 4) play a key role in the control of cell fate for a huge number of different kinds of cells, including stem cells.

È di vitale importanza che le cellule siano in grado di comunicare con l'ambiente circostante e di ricevere input da esso, oltre che tra loro, in modo preciso ed efficiente. Per reagire correttamente agli stimoli esterni, le cellule hanno sviluppato meccanismi di comunicazione avanzati che consentono loro di ricevere un'informazione, trasferire il messaggio attraverso la membrana plasmatica e infine rispondere producendo cambiamenti all'interno della cellula. Le cellule sono sensibili a una serie di stimoli diversi, a seconda del tipo di cellula e dell'ambiente in cui devono sopravvivere. Questi stimoli includono, tra gli altri Stimoli chimici, che sono quelli tipici utilizzati dalle cellule per comunicare tra loro, rilasciando molecole che vengono poi percepite dai recettori di altre cellule; Stimoli termici, poiché la termoregolazione è fondamentale in molti esseri viventi, le cellule sono sensibili alle variazioni di temperatura dell'ambiente, con recettori per il caldo e il freddo; Stimoli elettromagnetici di vario tipo, compresa la sensibilità alla luce per alcune cellule specializzate come quelle della retina; stimoli meccanici, in quanto lo stress meccanico e la rigidità dell'ambiente sono stimoli critici per una serie di processi cellulari, dalla crescita alla differenziazione fino alla morte. La via chimica di stimolazione e segnalazione è stata oggetto dei primi studi in medicina e biologia, diventando così il percorso classico di ricerca per lo sviluppo di metodi per stimolare e controllare il destino cellulare. Sono stati compiuti grandi sforzi nello sviluppo e nell'ottimizzazione di mezzi, fattori, agenti chimici e protocolli per dirigere e influenzare la crescita, la differenziazione, la migrazione e tutti i processi biologici delle cellule. Oggi queste tecniche e protocolli sono ampiamente valutati, affidabili ed efficaci, ma presentano ancora degli svantaggi. I più importanti sono la mancanza di reversibilità di questi stimoli e lo scarso controllo e precisione nel dominio spazio-temporale: ad esempio, è impossibile indirizzare una specifica sottopopolazione cellulare all'interno della stessa coltura in vitro. Un miglioramento di queste tecniche richiederebbe un controllo dinamico dell'ambiente extracellulare, offrendo così la possibilità di fornire stimoli precisi in punti temporali selezionati in modo più versatile. Di conseguenza, soprattutto negli ultimi decenni, si è registrato un crescente interesse e sforzo nel campo della ricerca di segnali biofisici, oltre a quelli biochimici, per sfruttare tutto lo spettro di stimoli che possono essere percepiti da diversi tipi di cellule. Tra gli altri spunti, l'uso della luce potrebbe offrire un enorme miglioramento nel controllo e nella risoluzione, sia nel dominio spaziale che temporale. Negli ultimi decenni si sono registrati importanti progressi tecnologici nel campo (ad esempio, la microscopia a due fotoni e il laser) che hanno aperto la strada a modi avanzati di controllare le cellule utilizzando la luce, con un'elevata risoluzione spaziale e temporale (rispettivamente fino a < 1 μm e < 1 ms). La fotostimolazione cellulare, tuttavia, presenta un'enorme limitazione: le cellule dei mammiferi non presentano alcuna sensibilità specifica alla luce (con alcune eccezioni, come i fotorecettori della retina). La ricerca si è quindi concentrata principalmente sul superamento di questa limitazione, impiegando elementi esterni che assorbono la luce e che possono agire come fototrasduttori - convertendo i segnali luminosi in stimolazione dell'attività cellulare. Di conseguenza, sono stati sviluppati numerosi sistemi di questo tipo, diversi per dimensioni, forma, materiale e principio di funzionamento. In questo lavoro di tesi di dottorato ho studiato diversi modi per ottenere un'efficace fotostimolazione delle cellule viventi. Le diverse fasi del mio percorso di ricerca sfruttano diversi elementi tra gli spettri di possibilità dati dal materiale (foto)attivo, dal tipo di cellula e dalla via di stimolazione da indirizzare. In particolare: nel capitolo 2 abbiamo utilizzato un polimero organico semiconduttore (P3HT) come substrato di coltura sensibile alla luce per influenzare il destino delle cellule staminali di derivazione adiposa umana (hASCs); nel capitolo 3 è stato testato un nuovo biomateriale, il seleniuro di indio (InSe), come substrato, con l'idea che il mix di proprietà elettriche e morfologiche possa influenzare in modo significativo la biologia cellulare; nel capitolo 4 l'interesse per le proprietà meccaniche del substrato per la stimolazione cellulare (introdotto nel capitolo 3) viene ulteriormente sviluppato, dallo studio biologico sul canale PIEZO1, alla stimolazione efficace delle cellule con un polimero a rigonfiamento controllato elettricamente, fino all'uso di substrati fotodeformabili a base di azobenzene. Il focus di questo lavoro di ricerca è partito dalla stimolazione delle cellule staminali con la luce, per poi spostarsi progressivamente verso una via di stimolazione finora meno esplorata, ovvero la meccanotrasduzione. C'è un doppio fil rouge che collega i diversi capitoli: la luce è proposta come controllore primario della stimolazione in questa ricerca. Questo è il punto di partenza nei capitoli 2 e 3, dove scegliamo il materiale fotoattivo come primo passo; mentre nel capitolo 4 concludiamo unicamente con l'idea di utilizzare un materiale fotoattivo per fotomodulare la nostra stimolazione. La stimolazione delle cellule staminali e il controllo del loro destino sono anche la motivazione della maggior parte delle ricerche, almeno come motore principale degli studi. Il capitolo 2 tratta direttamente della stimolazione delle hASC con i nostri materiali, mentre i capitoli successivi non riguardano esplicitamente le cellule staminali; tuttavia, gli stimoli meccanici provenienti dall'ambiente, siano essi passivi (come nel capitolo 3 per la morfologia) o attivi (come tutto ciò che abbiamo ottenuto nel capitolo 4), giocano un ruolo chiave nel controllo del destino cellulare per un numero enorme di tipi diversi di cellule, comprese le cellule staminali.