Organs-on-chip as advanced models of osteoarthritis and mechanically active body districts

The development of a new drug is estimated to require $ 2.8 billion [1, 2] and a time comprised between 10 and 15 years [3]. Moreover, only 10% of compounds considered in phase I clinical trials reach the market [3]. This inefficiency correlates with the lack of predictive preclinical disease models [4]. Classic 2D plasticware-based models were demonstrated to be over-simplified and ineffective drug response predictors [4]. Conversely, costly and time expensive animal models, beside presenting ethical concerns, cannot be adopted in the initial, high throughput, phases of chemical entities screenings [5]. Organs-on-chip (OoC) are microfluidic based devices aiming at recapitulating organ and tissue level functions in vitro [6]. Allowing an increased control over the experimental environment, OoCs are gaining increasing consensus as disease modelling tools. The ability to model diseases affecting mechanically active body districts, such as the musculoskeletal apparatus or the myocardium remains however an open challenge. This aspect becomes particularly relevant when proper disease mimicry requires the incorporation of multiple tissues. Moreover, most OoCs are currently limited to single chamber devices thus impairing their applicability as high throughput screening tools [7]. Case in point, osteoarthritis (OA) is a degenerative disease mainly affecting load bearing joints such as knees and hips. Exact estimates of OA prevalence vary depending on the considered definition of OA, the joint of interest, and the studied population [8]. Knee osteoarthritis was deemed to effect roughly 10% of men and 13% of women over the age of 60 [9]. Despite this, a successful OA treatment is currently missing [10] being existing therapeutic choices palliatives aimed at relieving symptoms rather than reversing the degenerative processes. OA is recognized as a multifactorial and complex disorder affecting the joint as a whole. OA pathological alterations include hyaline cartilage focal damage and degradation; chondrocyte assumption of a hypertrophic phenotype; vascular invasion, expansion towards the upper layers, and increase of the mineral content of calcified cartilage; and sclerosis and hypomineralization of subchondral bone. Indeed, the whole osteochondral unit (OCU) is affected [11, 12]. While no consensus is present regarding OA origin, a clear correlation between the pathology and mechanical risk factors such as trauma, joint misalignment and obesity has been demonstrated [13][14]. The lack of disease modifying anti-OA drugs was associated to the absence of relevant preclinical OA models [15]. The generation of representative OA models is however challenging given the difficulty of representing the multitude of tissues involved as well as the natural mechanically active joint environment. In this framework, the present PhD work aimed at exploiting OoCs principles and microfabrication techniques together with tissue engineering, to develop disease relevant models of mechanically active tissues with a particular focus on OA. The final aim was broke-down into five subsections, each aimed at delivering a specific technological or biological advancement. i) Initially, a mechanically active OoC platform capable of providing three dimensional (3D) constructs with physiological (i.e. 10%) or hyperphysiological (i.e. 30%) compressive levels was designed, functionally validated, and exploited to achieve (i) a healthy cartilage on chip model (CoC) positive for the deposition of cartilage extracellular matrix constituents (e.g. collagen type II and aggrecan) and to (ii) induce OA traits in the CoC through the sole application of hyperphysiological compression. Specifically, it was feasible to recapitulate the imbalance of catabolic and anabolic processes, the increased inflammatory state, and the hypertrophic phenotype characterizing cartilage in OA. The model was also exploited to evaluate the response to known and innovative anti OA compounds. ii) The adoption of OoCs as possible testing systems in drug screening campaigns depends on the achievement of a satisfactory experimental throughput. A platform capable of subjecting multiple independent 3D constructs to cyclical mechanical stimulation was engineered and functionally validated. Appropriately designed valves positioned between the different culture chambers allowed to inject multiple compartments with a single operation while assuring their independence during the culture period. As a proof of concept, the device was adopted to apply cyclical strain to cardiomyocytes and fibroblasts co-cultures recapitulating some traits of cardiac fibrosis. The device was then modified to make it suitable for the study of OA, shifting its mechanical stimulation from the stretching to the compression of hosted tissues. iii) Cartilage and bone are examples of tissues with a hierarchical organization. During OA the whole OCU is affected leading to altered tissues mechanical properties. A direct assessment of the mechanical, compositional and morphological alterations characterizing the different OCU tissues of OA patients was performed focusing on a dimensional scale relevant for developing future complex OA models based on the OoC technology. Specifically, indentation type atomic force microscopy (IT-AFM) was adopted to study OCU tissues mechanical properties at a sub-micrometre scale and differentiating between hyaline cartilage zones, and calcified cartilage and subchondral layers. The technique was then translated to the determination of the mechanical properties of cartilaginous microconstructs. iv) While the whole OCU is affected by OA, most in vitro models are limited to the study of cartilage. Modelling physiologically relevant mechanical stimulation in other OCU layers remains a challenge. To fill this gap, a new OoC platform enabling the provision of well-defined and discrete levels of mechanical compression to directly interfaced superimposed 3D microconstructs was designed. Specifically, a new microfluidic concept (namely Vertical Capillary burst Valve, VBV) was introduced, consenting the vertical superimposition of two 3D cell-laden hydrogels and the spatially precise modulation of the strain field experienced by the two tissues. The device was validated demonstrating that different layers of cartilaginous constructs can be subjected to various levels of compression resulting in distinct mechanotransduction signalling. The platform was then exploited to demonstrate that local perturbations in the composition of acellular subchondral layers resulted in modulations of the loading response of cartilage-like constructs. v) Finally, the culture conditions to obtain cellular microconstructs recapitulating multiple OCU layers were investigated. Specifically, primary human articular chondrocytes (hACs) and mesenchymal stromal cells (MSCs) were differentiated, respectively, in hyaline cartilage and calcified cartilage. A biphasic microconstruct integrating the two tissues was then achieved through a specifically designed OoC platform allowing a direct interface between two adjacent cell-laden hydrogels. The model was further integrated with a vascular compartment, used to preliminary assess how endothelial cells influence MSCs differentiation. Finally, providing spatially discrete mechanical compression to the obtained biphasic constructs, a preliminary evaluation of the effect of loading was performed.   References 1. Wouters OJ, McKee M, Luyten J (2020) Estimated Research and Development Investment Needed to Bring a New Medicine to Market, 2009-2018. JAMA 323:844–853. https://doi.org/10.1001/JAMA.2020.1166 2. Dierynck B, Joos P (2020) Research and Development Costs of New Drugs. JAMA 324:516–517. https://doi.org/10.1001/JAMA.2020.8642 3. Takebe T, Imai R, Ono S (2018) The Current Status of Drug Discovery and Development as Originated in United States Academia: The Influence of Industrial and Academic Collaboration on Drug Discovery and Development. Clin Transl Sci 11:597–606. https://doi.org/10.1111/cts.12577 4. Horvath P, Aulner N, Bickle M, et al (2016) Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nat Rev Drug Discov 15:751–769. https://doi.org/10.1038/nrd.2016.175 5. Probst C, Schneider S, Loskill P (2018) High-throughput organ-on-a-chip systems: Current status and remaining challenges. Curr. Opin. Biomed. Eng. 6:33–41 6. Bhatia SN, Ingber DE (2014) Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol 2014 328 32:760–772. https://doi.org/10.1038/nbt.2989 7. Schneider O, Zeifang L, Fuchs S, et al (2019) User-Friendly and Parallelized Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microtissues in a Centrifugal Heart-on-a-Chip. Tissue Eng Part A 25:786–798. https://doi.org/10.1089/ten.tea.2019.0002 8. Vina ER, Kwoh CK (2018) Epidemiology of Osteoarthritis: Literature Update. Curr Opin Rheumatol 30:160. https://doi.org/10.1097/BOR.0000000000000479 9. Zhang Y, Jordan JM (2010) Epidemiology of Osteoarthritis. Clin Geriatr Med 26:355. https://doi.org/10.1016/J.CGER.2010.03.001 10. Kloppenburg M, Berenbaum F (2020) Osteoarthritis year in review 2019: epidemiology and therapy. Osteoarthr Cartil 28:242–248. https://doi.org/10.1016/j.joca.2020.01.002 11. Loeser RF, Goldring SR, Scanzello CR, Goldring MB (2012) Osteoarthritis: A Disease of the Joint as an Organ. Arthritis Rheum 64:1697. https://doi.org/10.1002/ART.34453 12. Goldring SR, Goldring MB (2016) Changes in the osteochondral unit during osteoarthritis: structure, function and cartilage–bone crosstalk. Nat Rev Rheumatol 12:632–644. https://doi.org/10.1038/nrrheum.2016.148 13. He Y, Li Z, Alexander PG, et al (2020) Pathogenesis of Osteoarthritis: Risk Factors, Regulatory Pathways in Chondrocytes, and Experimental Models. Biol 2020, Vol 9, Page 194 9:194. https://doi.org/10.3390/BIOLOGY9080194 14. Andriacchi TP, Mündermann A (2006) The role of ambulatory mechanics in the initiation and progression of knee osteoarthritis. Curr Opin Rheumatol 18:514–518. https://doi.org/10.1097/01.BOR.0000240365.16842.4E 15. CI J, DJ A, DN C (2016) In vitro models for the study of osteoarthritis. Vet J 209:40–49. https://doi.org/10.1016/J.TVJL.2015.07.011  

Il costo per lo sviluppo di un singolo nuovo farmaco è oggi stimato intorno ai 2.8 miliardi di dollari [1, 2] con tempi compresi fra i 10 ed i 15 anni [3]. Inoltre, solo il 10 % dei farmaci che entrano nei test clinici di fase I raggiunge effettivamente il mercato [3]. Questa inefficienza è correlata alla mancanza, in fase preclinica, di modelli patologici predittivi [4]. I modelli 2D basati su culture cellulari in piastra sono infatti over-semplicistici ed inefficaci nel predire l’effetto terapeutico dei farmaci in vivo [4]. D’altra parte, i modelli animali, oltre a presentare problematiche etiche, sono costosi e richiedono lunghe tempistiche sperimentali, spesso non compatibili con le fasi iniziali dei test farmacologici, le quali necessitano di un throughput elevato [5]. Gli organi-su-chip (OoC) sono dispositivi microfluidici per colture cellulari avanzate che mirano a ricapitolare in vitro le unità funzionali degli organi nativi [6]. Permettendo uno stretto controllo delle condizioni sperimentali, gli OoC stanno acquisendo un crescente consenso come modelli per lo studio di varie patologie. Rappresentare in vitro patologie che colpiscono distretti corporei caratterizzati da un ambiente meccanico attivo, come il sistema muscoloscheletrico o il muscolo cardiaco, rimane tuttavia una sfida aperta. Questo aspetto risulta particolarmente problematico quando è richiesto lo studio simultaneo di più tessuti interconnessi a formare distretti funzionali (come nel caso delle articolazioni). Inoltre, la maggior parte delle soluzioni basate sulla tecnologia degli OoC è costituita da dispositivi contenenti una singola camera di cultura e questo limita il loro possibile utilizzo come strumenti per test a throughput elevato [7]. L’osteoartrosi (OA), patologia degenerativa che colpisce soprattutto articolazioni soggette a carico meccanico come ginocchia ed articolazione acetabolo-femorale, è un esempio paradigmatico. Le stime sulla sua prevalenza variano a seconda della definizione di OA, dell’articolazione interessata o della popolazione campione [8]. L’osteoartrosi al ginocchio, per esempio, colpisce circa il 10% degli uomini ed il 13 % delle donne sopra l’età di 60 anni [9]. A dispetto dell’ampia diffusione tuttavia, una terapia efficacie non è ancora disponibile [10] e le attuali opzioni terapeutiche sono limitate a palliativi volti a diminuire i sintomi piuttosto che a invertire i processi degenerativi. L’ OA è riconosciuta come una complessa patologia multifattoriale che interessa l’intera articolazione. Le alterazioni patologiche includono danni focali e degenerazione della cartilagine ialina con l’assunzione di un fenotipo ipertrofico da parte dei condrociti (i.e. la popolazione cellulare residente); invasione vascolare, espansione, ed aumento del contenuto minerale della cartilagine calcificata; e sclerosi ed ipo-mineralizzazione dell’osso sub-condrale. Di fatto, l’intera unita osteocondrale (OCU) viene colpita [11, 12]. Mentre un pieno consenso riguardo alle cause dell’OA non è stato raggiunto, vi sono evidenze che indicano una correlazione fra l’insorgere della patologia e fattori che comportano alterazioni della meccano-biologia articolare quali traumi pregressi, disallineamento articolare, ed obesità [13][14]. L’assenza di trattamenti farmacologici è stata associata alla mancanza di modelli predittivi da utilizzare in fase preclinica [15]. La generazione di modelli rilevanti di OA è infatti ostacolata dalla necessità di rappresentare sia la moltitudine dei tessuti affetti che l’ambiente meccanicamente attivo che contraddistingue le articolazioni. All’interno di questo contesto, il presente lavoro di dottorato è stato focalizzato sull’utilizzo delle tecnologie degli OoC, della microfabbricazione, e dell’ingegneria tissutale, per lo sviluppo di modelli rilevanti di patologie che interessano distretti corporei meccanicamente attivi, incentrandosi sull’OA come applicazione principale. L’obiettivo finale è stato suddiviso in cinque sottosezioni, ciascuna voluta a raggiungere uno specifico avanzamento tecnologico o biologico. i) Inizialmente, è stato progettato un dispositivo OoC capace di sottoporre costrutti tridimensionali (3D) a livelli fisiologici (i.e. 10%) o iperfisiologici (i.e. 30%) di compressione meccanica. Tale dispositivo è stato validato ed utilizzato (i) per ottenere un modello di cartilagine su chip ricco in costituenti della matrice extracellulare nativa (p.e. collagene di tipo II ed aggrecano) e (ii) per indurre nello stesso modello alcuni dei tratti tipici dell’OA unicamente attraverso una compressione iperfisiologica. Nel dettaglio, è stato possibile ricapitolare lo sbilanciamento tra i processi catabolici ed anabolici, lo stato infiammatorio, ed il fenotipo ipertrofico che caratterizzano la cartilagine nell’OA. Il modello è anche stato utilizzato per valutare la risposta a diversi composti anti-OA fra cui farmaceutici sperimentali. ii) L’utilizzo degli OoC come strumenti per svolgere test farmacologici preclinici dipende dall’ottenimento di un throughput sperimentale sufficiente. Per rispondere a questo fabbisogno è stato sviluppato un dispositivo OoC capace di esporre costrutti cellulari multipli e indipendenti ad una stimolazione meccanica. In particolare, l’introduzione di un sistema di valvole poste fra le diverse camere di cultura (e quindi fra i costrutti) permette di riempire tutte le camere con una sola operazione di semina, assicurando al contempo la loro indipendenza durante il periodo di cultura. Come caso di studio, il dispositivo è stato utilizzato per valutare l’effetto di uno stretching ciclico su co-culture di fibroblasti e cardiomiociti replicando alcuni tratti tipici della fibrosi cardiaca. Il dispositivo è stato poi modificato perché potesse essere applicato allo studio dell’OA, tramutando la tipologia di stimolazione meccanica applicata ai costrutti nel dispositivo dallo stretching alla compressione. iii) Cartilagine ed osso sono esempi di tessuti con un’organizzazione gerarchica. L’OA colpisce l’intera OCU causando alterazioni nelle proprietà meccaniche dei singoli tessuti. Una valutazione diretta delle alterazioni meccaniche, di composizione, e strutturali dei vari tessuti dell’OCU isolati da pazienti affetti da OA è stata eseguita, concentrandosi su una scala dimensionale rilevante per sviluppare futuri modelli complessi di OA basati sulle tecnologie OoC. Nello specifico, la tecnica dell’IT-AFM (i.e. indentation type atomic force microscopy) è stata utilizzata per evidenziare come, in seguito ai processi degenerativi dell’OA, le proprietà meccaniche dei vari tessuti dell’OCU varino ad una scala sub-micrometrica, con differenze settoriali fra cartilagine ialina, cartilagine calcificata ed osso sub-condrale. La tecnica è stata poi usata per determinare le proprietà meccaniche di costrutti cartilaginei ottenuti in una piattaforma microfluidica. iv) Nonostante l’OA colpisca l’intera OCU, la maggior parte dei modelli in vitro esistenti considera solo il tessuto cartilagineo. L’introduzione di modelli meccanicamente attivi che rappresentino l’intera OCU è ancora una sfida aperta. Per colmare questa lacuna è stata introdotta una nuova piattaforma OoC che permette di sottoporre costrutti bifasici complessi a livelli discreti di compressione meccanica. Nello specifico, uno nuovo concetto microfluidico, denominato “Vertical capillary Burst Valve”, è stato introdotto, consentendo (i) la sovrapposizione spaziale di due micro costrutti cellulari ed (ii) il controllo posizionale sul campo di deformazione a cui i costrutti sono sottoposti nel dispositivo. Il dispositivo è stato poi validato dimostrando come due costrutti cartilaginei seminati nei due compartimenti del dispositivo siano effettivamente sottoposti a livelli di stimolazione meccanica diversi, risultando in una diversa attivazione dei rispettivi meccanismi di meccanotransduzione. La piattaforma è stata infine utilizzata per dimostrare come variazioni locali nelle proprietà dello strato sub-condrale della OCU influenzino la risposta dei costrutti cartilaginei alla stimolazione meccanica. v) Da ultimo sono state investigate le condizioni per ottenere micro-costrutti cellulari compositi, rappresentativi di diversi tessuti dell’OCU. Condrociti articolari primari e cellule mesenchimali stromali (MSCs) sono stati usati per ottenere, rispettivamente, micro-costrutti con le caratteristiche di cartilagine ialina a calcificata. Tramite un dispositivo disegnato opportunamente per permettere una interfaccia diretta fra due compartimenti cellulari è poi stato ottenuto un costrutto bifasico comprensivo di entrambi i tessuti. Il modello è stato completato con l’introduzione di una componente vascolare per valutare, in modo preliminare, come le cellule endoteliali influenzino la differenziazione delle MSCs. Da ultimo è stata eseguita una prima valutazione dell’effetto della stimolazione meccanica (iperfisiologica) su questi costrutti complessi.   Referenze 1. Wouters OJ, McKee M, Luyten J (2020) Estimated Research and Development Investment Needed to Bring a New Medicine to Market, 2009-2018. JAMA 323:844–853. https://doi.org/10.1001/JAMA.2020.1166 2. Dierynck B, Joos P (2020) Research and Development Costs of New Drugs. JAMA 324:516–517. https://doi.org/10.1001/JAMA.2020.8642 3. Takebe T, Imai R, Ono S (2018) The Current Status of Drug Discovery and Development as Originated in United States Academia: The Influence of Industrial and Academic Collaboration on Drug Discovery and Development. Clin Transl Sci 11:597–606. https://doi.org/10.1111/cts.12577 4. Horvath P, Aulner N, Bickle M, et al (2016) Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nat Rev Drug Discov 15:751–769. https://doi.org/10.1038/nrd.2016.175 5. Probst C, Schneider S, Loskill P (2018) High-throughput organ-on-a-chip systems: Current status and remaining challenges. Curr. Opin. Biomed. Eng. 6:33–41 6. Bhatia SN, Ingber DE (2014) Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol 2014 328 32:760–772. https://doi.org/10.1038/nbt.2989 7. Schneider O, Zeifang L, Fuchs S, et al (2019) User-Friendly and Parallelized Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microtissues in a Centrifugal Heart-on-a-Chip. Tissue Eng Part A 25:786–798. https://doi.org/10.1089/ten.tea.2019.0002 8. Vina ER, Kwoh CK (2018) Epidemiology of Osteoarthritis: Literature Update. Curr Opin Rheumatol 30:160. https://doi.org/10.1097/BOR.0000000000000479 9. Zhang Y, Jordan JM (2010) Epidemiology of Osteoarthritis. Clin Geriatr Med 26:355. https://doi.org/10.1016/J.CGER.2010.03.001 10. Kloppenburg M, Berenbaum F (2020) Osteoarthritis year in review 2019: epidemiology and therapy. Osteoarthr Cartil 28:242–248. https://doi.org/10.1016/j.joca.2020.01.002 11. Loeser RF, Goldring SR, Scanzello CR, Goldring MB (2012) Osteoarthritis: A Disease of the Joint as an Organ. Arthritis Rheum 64:1697. https://doi.org/10.1002/ART.34453 12. Goldring SR, Goldring MB (2016) Changes in the osteochondral unit during osteoarthritis: structure, function and cartilage–bone crosstalk. Nat Rev Rheumatol 12:632–644. https://doi.org/10.1038/nrrheum.2016.148 13. He Y, Li Z, Alexander PG, et al (2020) Pathogenesis of Osteoarthritis: Risk Factors, Regulatory Pathways in Chondrocytes, and Experimental Models. Biol 2020, Vol 9, Page 194 9:194. https://doi.org/10.3390/BIOLOGY9080194 14. Andriacchi TP, Mündermann A (2006) The role of ambulatory mechanics in the initiation and progression of knee osteoarthritis. Curr Opin Rheumatol 18:514–518. https://doi.org/10.1097/01.BOR.0000240365.16842.4E 15. CI J, DJ A, DN C (2016) In vitro models for the study of osteoarthritis. Vet J 209:40–49. https://doi.org/10.1016/J.TVJL.2015.07.011