PROTECTION OF AGRO-BIODIVERSITY AND LOCAL PRODUCTIONS THROUGH THE USE OF NEW SELECTIVE BIOPESTICIDES

The huge use of conventional insecticides in crop protection has led to environmental pollution, negative effects on human health and non-target organisms (i.e. useful insects, plants, aquatic organisms, mammals, invertebrates, etc.), and increased insect resistance phenomena that limit the efficacy of control treatments. For these reasons, in the last decade, the development and use of alternative control tools to conventional pesticides have had a growing interest. Among the alternatives, botanical extracts, in particular essential oils (EOs), seem to be ideal candidates for use as bioinsecticides due to certain characteristics (i.e. wide distribution, low cost, insecticidal activity, attractiveness to pollinators, presumed safety towards natural antagonists, etc.). On the other hand, these natural substances have some negative properties (i.e. flammability, volatility, rapid degradation, phytotoxicity, poor solubility in water) which limit or prevent their use in real world conditions. In recent years, the use of nanotechnology as a tool for developing EO-based nanopesticides (EO-NPs) attracted the interest of different stakeholders. The advantage of using nanotechnology lies in the possibility of mitigating the typical disadvantages of these extracts and improving the chemical, physical and biological properties of their insecticide formulations. In this context, the proposed PhD thesis aimed at the development of new and eco-friendly EO-NPs and to investigate their biological activity against some key citrus pests such as Planococcus citri Risso and Delottococcus aberiae De Lotto (Hemiptera: Pseudococcidae) and Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae). The undesired effects towards different non-target organisms (natural enemies, pollinators and plants) were also investigated. To achieve the aim of the thesis, firstly, the chemical profiles of the EOs were evaluated using a gas chromatography/mass spectrometry (GC-MS) apparatus. Then EO-NPs were developed through mixed bottom-up and top-down processes in order to assess the best production method. The developed nano-emulsions were physically characterised through Dynamic Light Scattering (DLS) analysis and particle size, polydispersity index (PDI), surface charge and stability over time were estimated. The most promising EO-NPs were tested against target insects and lethal doses (LD50 and LD90) were estimated. To investigate the insecticidal efficacy and the mode of action of the developed formulations, the estimated LDs were used in different bioassays involving both target and non-target species. Further analyses were carried out on plants to assess the phytotoxic effects and the influence on different genes involved in the salicylic acid (SA) and jasmonic acid (JA) pathways. Overall, the research activities allowed to identify the best method for obtaining stable EO-NPs and proved the high insecticidal activity of these nanoformulations against target insects. 7 In addition, the overexpression in SA and JA genes underlines a dual benefit action (direct pest control - enhance plant defences) of developed EO-NPs. The results towards non-target insects highlighted the safety of the EO-NPs in indirect and topical treatments while a high mortality rate was registered when applied by ingestion route. The obtained results highlighted the potential of these promising formulations for their use in IPM or biological control programs.

L'uso massiccio degli insetticidi convenzionali per la protezione delle colture ha portato all'inquinamento ambientale, a effetti negativi sulla salute umana e sugli organismi non bersaglio (es. insetti utili, piante, organismi acquatici, mammiferi, invertebrati, ecc.). Per questi motivi, nell'ultimo decennio lo sviluppo e l'uso di strumenti di controllo alternativi ai pesticidi convenzionali hanno suscitato un crescente interesse. Tra le alternative, gli estratti botanici, in particolare gli oli essenziali (OE), sembrano essere i candidati ideali per essere utilizzati come bioinsetticidi grazie ad alcune caratteristiche (es. ampia distribuzione, basso costo, attività insetticida, attrattiva per gli impollinatori, presunta sicurezza nei confronti degli antagonisti naturali, ecc.) D'altra parte, queste sostanze naturali hanno alcune proprietà negative (es. infiammabilità, volatilità, rapida degradazione, fitotossicità, scarsa solubilità in acqua), che ne limitano o impediscono l'uso nelle reali condizioni operative. Negli ultimi anni, l'uso delle nanotecnologie come strumento per lo sviluppo di nanopesticidi a base di OE ha suscitato l'interesse delle diverse parti interessate. Il principale vantaggio delle nanotecnologie risiede nella capacità di mitigare gli svantaggi tipici di questi estratti e di ottimizzare le proprietà chimiche, fisiche e biologiche delle relative formulazioni insetticide. In questo contesto, la tesi di dottorato proposta ha avuto come obiettivo lo sviluppo di nuove formulazioni ecocompatibili a base di OE e lo studio della loro attività biologica contro alcuni parassiti chiave degli agrumi come Planococcus citri Risso, Delottococcus aberiae De Lotto (Hemiptera: Pseudococcidae) e Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae). Inoltre, sono stati studiati anche gli effetti indesiderati nei confronti di diversi organismi non bersaglio (nemici naturali, impollinatori e piante). Per raggiungere l'obiettivo della tesi, in primo luogo sono stati valutati i profili chimici degli OE utilizzando lo strumento gas-cromatografo/spettrometro di massa (GC-MS). Successivamente, sono state sviluppate le formulazioni attraverso processi misti bottom up e top-down, al fine di valutare il metodo di produzione migliore. Le nano-emulsioni sviluppate sono state caratterizzate fisicamente mediante analisi di Diffusione Dinamica della Luce (DLS), e sono state stimate le dimensioni delle particelle, l'indice di polidispersione (PDI), la carica superficiale e la stabilità nel tempo. Le formulazioni più promettenti sono state testate contro gli insetti bersaglio e sono state stimate le dosi letali (DL50 e DL90). Per studiare l'efficacia insetticida e le modalità di azione delle formulazioni sviluppate, le DL stimate sono state utilizzate in diversi biotest che hanno coinvolto specie bersaglio e non bersaglio. Ulteriori analisi sono state condotte sulle piante per valutare i potenziali effetti di fitotossicità e l'influenza su diversi geni coinvolti nelle vie dell'acido salicilico (SA) e dell'acido jasmonico (JA). Nel complesso, le attività di ricerca hanno 9 permesso di identificare il metodo migliore per ottenere formulazioni stabili, e hanno dimostrato l'elevata attività insetticida di queste nanoformulazioni contro gli insetti bersaglio. Inoltre, la sovraespressione dei geni SA e JA ha sottolineato un duplice effetto delle formulazioni sviluppate (controllo diretto dei parassiti - potenziamento delle difese delle piante). I risultati sugli insetti non bersaglio hanno dimostrato la sicurezza delle formulazioni nei trattamenti indiretti e topici, mentre hanno evidenziato un alto tasso di mortalità quando sono stati applicati per ingestione. I risultati ottenuti evidenziano le potenzialità di queste promettenti formulazioni per il loro impiego nei programmi di lotta biologica o di gestione integrata dei parassiti (IPM).