LNA-ASO based therapy for the treatment of SARS-CoV-2 infection in pre-clinicals models

La crisi da COVID-19 e lo sviluppo del primo vaccino approvato a base di mRNA hanno messo in luce il potenziale delle strategie terapeutiche basate sull'RNA. Varianti mutate di SARS-CoV-2, capaci di sfuggire all'immunità acquisita derivante da precedenti infezioni o vaccinazioni, continuano ad emergere e a causare nuovi focolai. Vi e’ un bisogno urgente di approcci alternativi efficaci contro le nuove varianti di interesse. In questo contesto, gli oligonucleotidi antisenso (ASOs) rappresentano una classe promettente di agenti terapeutici. Il mio studio ha progettato, valutato e ottimizzato ASOs mirati all'RNA di SARS-CoV-2, con l'obiettivo di sviluppare una strategia terapeutica scalabile e capace di adattarsi all'evoluzione del virus. Integrando bioinformatica, screening in vitro e ottimizzazione della somministrazione sono stati identificati i principali fattori che influenzano l'efficacia degli ASOs, evidenziando le sfide ma anche il grande potenziale di questo approccio. Ho progettato ventiquattro ASOs complementari a regioni altamente conservate e a singolo filamento del genoma del SARS-CoV-2, al fine di massimizzare l'efficacia ad ampio spettro contro più varianti. Lo screening e le ottimizzazioni in vitro hanno portato all'identificazione di quattro ASOs modificati con LNA che hanno dimostrato un'efficacia eccezionale. Questi LNA-ASOs hanno ridotto significativamente gli RNA intracellulari per la proteina Spike e per la Nucleoproteina virale in quattro varianti di SARS-CoV-2. Tuttavia, i primi esperimenti effettuati con somministrazione mediante lipofectamina hanno rivelato problemi di tossicità. È inoltre emerso che il trattamento con LNA-ASOs non altera significativamente l'espressione dei geni indotti dall'interferone, sia in cellule infette che non infette, suggerendo che i problemi di tossicità fosssero dovuti principalmente al metodo di somministrazione. Inoltre, è stato osservata una limitata capacita’ di transfezione degli LNA-ASOs "nudi" nei polmoni in vivo. Nel loro insieme questi risultati hanno evidenziato un problema da risolvere nella somministrazione agli organi bersaglio. Ho quindi condotto un’ottimizzazione del metodo di somministrazione. Questa esplorazione ha portato all’uso di sistemi di somministrazione a base polimerica: i polimeri P(SpAA-co-DAA) H-26 e JH-27. Questi polimeri innovativi hanno migliorato la transfezione degli LNA-ASOs e hanno ridotto la tossicità rispetto alla lipofectamina. La progettazione di questi polimeri si è basata su un approccio razionale, tenendo conto di fattori come densità di carica, biodegradabilità e capacità entrare e uscire dagli endosomi. Tuttavia, in modo inaspettato, la combinazione del polimero JH-27 con LNA-ASOs non è risultata sufficientemente efficace nel ridurre i titoli virali nelle cellule A549-hACE2. Complessivamente, questi risultati rappresentano un approccio metodologico rigoroso, dalla progettazione iniziale agli esperimenti in vivo, per lo sviluppo di una terapia antivirale basata sull'RNA.

The COVID-19 crisis and the development of the first approved mRNA vaccine have highlighted the potential of RNA-based therapeutic strategies. Mutated variant strains of SARS-CoV-2 that evade immunity to previous infection or vaccination are continuously emerging, resulting in new outbreaks. Thus, there is a clear and urgent need for alternative approaches that are active against multiple variants of concern. Antisense oligonucleotides (ASOs) represent a new and promising class of RNA-targeted therapy. This study explored the design, evaluation, and optimization of ASOs targeting SARS-CoV-2 RNA, with the aim of providing a scalable therapeutic strategy capable of adapting to viral evolution. By integrating bioinformatics, in vitro screening, and delivery optimization, we report the key factors influencing ASO efficacy and highlight the challenges but also the potential of this approach. Twenty-four ASOs were designed to target highly conserved, single-stranded regions of the SARS-CoV-2 genome, for maximal broad-spectrum efficacy against multiple variants. Extensive in vitro screening and optimization led to the identification of four LNA-modified ASOs that exhibited exceptional efficacy. These LNA-ASOs significantly reduced intracellular Spike RNA and virion Nucleoprotein RNA across 4 SARS-CoV-2 variants, highlighting them as potential therapeutic candidates. Initial experiments utilizing lipofectamine-based delivery methods revealed toxicity concerns. Therefore, optimization of the delivery method was carried out. Interestingly, we discovered that treatment with LNA-ASOs did not significantly alter the expression of interferon-stimulated genes when cells were either infected or not, demonstrating toxicity concerns were likely due to the delivery method alone. However, limited uptake of naked LNA-ASOs in the lung was observed in vivo, highlighting the challenge of ASO delivery to target cells. The exploration of a less toxic approach led us to the use of polymer-based delivery systems: P(SpAA-co-DAA) polymers (JH-26 and JH-27). These innovative polymers demonstrated improved LNA-ASO uptake and reduced toxicity compared to lipofectamine. The design of these polymers was based on a rational approach, considering factors such as charge density, biodegradability, and endosomal escape capabilities. Unexpectedly, the combination of JH-27 polymer with LNA-ASOs did not perform as effectively in reducing viral titers in A549-hACE2 cell. Taken together, these findings highlight a meticulous methodological approach to the development of an RNA-based anti-viral therapy from design to in vivo experimentation.