Setting up a novel preterm rabbit bronchopulmonary dysplasia multi-hit model of perinatal injury

Bronchopulmonary dysplasia (BPD) is a chronic lung disease that affects premature infants and impairs their respiratory development. BPD results from multiple factors, including prenatal influences such as inflammation, maternal behavior, antenatal corticosteroids, environmental conditions, and genetic predisposition, as well as from postnatal factors such as mechanical ventilation, excess oxygen, infection and inadequate nutrition. All of these factors affect alveolarization, airway structure and pulmonary vascular development. Animal models of BPD are essential for studying this complex pathology. Preterm rabbits born at 28 days gestation and exposed to high oxygen levels (95% or 70%) develop either severe or mild BPD phenotypes, respectively. However, a limitation of these two models is that they only include two factors - prematurity and oxygen exposure - whereas BPD in humans involves additional influences. Based on this, my PhD project aimed to extend the translational value of these hyperoxic preterm rabbit models to obtain an animal model with additional perinatal features that better mimic the clinical scenario. Several hits were tested, such as postnatal sepsis, gradual oxygen weaning, abrupt oxygen weaning, antenatal corticosteroids, intrauterine growth restriction (IUGR) and chorioamnionitis (CA). Postnatal sepsis was induced by LPS injections on postnatal day (PND) 3 and 5, combined with 70% O2 exposure for 14 days. The gradual weaning protocol consisted of 7 days of exposure to 95% O2, followed by a progressive reduction in oxygen concentration to 21% O2 by day 14. In the abrupt weaning protocol, preterm rabbits were exposed to 70% O2 for 14 days, followed by an immediate switch to 21% O2 until day 21. Regarding prenatal insults, betamethasone, a corticosteroid, was administered to pregnant rabbits 48 and 24 hours before premature delivery. Subsequently, premature rabbits were exposed to either 21% O2 or 70% O2 for 14 days. IUGR was induced by administering L-NG-Nitroarginine Methyl Ester (L-NAME), a selective nitric oxide synthase inhibitor, to pregnant rabbits from gestational days 24 to 27, and the preterm offspring was subsequently exposed to either 21% O2 or 70% O2 for 14 days. Lastly, CA was induced by intra-amniotic injections of LPS to pregnant rabbits on gestational day 25, and preterm rabbits were exposed to 50% O2 for 7 days. Several of these protocols (i.e., postnatal sepsis, gradual and abrupt oxygen weaning, and IUGR) were discontinued due to high mortality within the experimental session, and only the CA seemed the most promising. Specifically, the administration of 2.5 μg/sac of LPS to preterm rabbits resulted in fetal growth restriction at birth, lung structural impairments, and dysregulation of key markers related to alveolar development, inflammation, and oxidative stress. Interestingly, despite these adverse outcomes, LPS also improved lung function, as indicated by increased SFTPC mRNA levels. Thus, further studies are needed to fully understand the short- and long-term effects of LPS-induced CA on lung development in preterm rabbits.

La displasia broncopolmonare (BPD) è una malattia polmonare cronica che colpisce i neonati prematuri compromettendo lo sviluppo del loro sistema respiratorio. La BPD è il risultato di molteplici fattori, tra cui influenze prenatali come infiammazione, comportamento materno, corticosteroidi antenatali, condizioni ambientali e predisposizione genetica, oltre a fattori postnatali quali ventilazione meccanica, eccesso di ossigeno, infezioni e nutrizione inadeguata. Tutti questi elementi incidono sull’alveolarizzazione, sulla struttura delle vie aeree e sullo sviluppo vascolare polmonare. I modelli animali di BPD sono fondamentali per studiare questa patologia complessa. I conigli pretermine nati a 28 giorni di gestazione ed esposti a livelli elevati di ossigeno (95% o 70%) sviluppano rispettivamente fenotipi di BPD grave o lieve. Tuttavia, una limitazione di questi due modelli è che includono solo due fattori – prematurità ed esposizione all’ossigeno – mentre la BPD negli esseri umani è influenzata da molte altre variabili. Alla luce di ciò, il mio progetto di dottorato mira a estendere il valore traslazionale di questi modelli iperossici di coniglio pretermine, sviluppando un modello animale con caratteristiche che rappresentassero meglio il quadro clinico. Sono stati testati la sepsi postnatale, il weaning graduale e improvviso dall’ossigeno, i corticosteroidi antenatali, il ritardo della crescita intrauterina (IUGR) e la corioamnionite (CA). La sepsi postnatale è stata indotta mediante iniezioni di LPS nei giorni postnatali (PND) 3 e 5, in combinazione con l’esposizione al 70% di ossigeno per 14 giorni. Il protocollo di weaning graduale prevedeva 7 giorni di esposizione al 95% di ossigeno, seguiti da una riduzione progressiva della concentrazione fino al 21% entro il giorno 14. Nel protocollo di weaning improvviso, i conigli pretermine sono stati esposti al 70% di ossigeno per 14 giorni, seguiti da un passaggio immediato al 21% fino al giorno 21. Per quanto riguarda gli insulti prenatali, il betametasone, un corticosteroide, è stata somministrata alle coniglie gravide 48 e 24 ore prima del parto prematuro. Successivamente, i conigli prematuri sono stati esposti al 21% o al 70% di ossigeno per 14 giorni. L’IUGR è stato indotto somministrando L-NG-Nitroarginina Metil Estere (L-NAME), un inibitore selettivo della sintasi dell’ossido nitrico, a coniglie gravide dal giorno gestazionale 24 al 27, e i conigli nati prematuri sono stati poi esposti al 21% o al 70% di ossigeno per 14 giorni. Infine, la CA è stata indotta tramite iniezioni intra-amniotiche di LPS alle coniglie gravide nel giorno gestazionale 25, e i conigli prematuri sono stati esposti al 50% di ossigeno per 7 giorni. La maggior parte di questi protocolli (sepsi postnatale, svezzamento graduale e improvviso dall’ossigeno e IUGR) sono stati interrotti a causa dell’elevata mortalità durante la sessione sperimentale, mentre la CA si è dimostrata la più promettente. In particolare, la somministrazione di LPS 2,5 μg/sacco ai conigli prematuri ha causato restrizione della crescita fetale alla nascita, compromissioni strutturali polmonari e disregolazione di marcatori chiave legati allo sviluppo alveolare, all’infiammazione e allo stress ossidativo. È interessante notare che, nonostante questi esiti avversi, l’LPS ha anche migliorato la funzionalità polmonare, come indicato dai livelli aumentati di SFTPC. Sono quindi necessari ulteriori studi per comprendere appieno gli effetti a breve e lungo termine della CA indotta da LPS sullo sviluppo polmonare nei conigli prematuri.