Natural products for the prevention of infectious diseases and for the mitigation of the environmental impact of livestock

Negli ultimi anni, la produzione mondiale di bestiame è aumentata costantemente, principalmente a causa di una crescente domanda di prodotti di origine animale per il consumo umano. Allo stesso tempo, tuttavia, sono emerse alcune preoccupazioni, come la crescente resistenza agli antibiotici e l’aumento delle emissioni di gas serra associate all’allevamento intensivo. Uno degli approcci più esplorati in letteratura, sia come alternativa agli antimicrobici che per la riduzione delle emissioni, in particolare del metano, è l’uso di composti di origine vegetale. Nell’alimentazione animale, l’uso di composti attivi derivati da sottoprodotti vegetali, specialmente in forma libera, è spesso limitato dalla loro ridotta biodisponibilità nel tratto gastrointestinale, oltre che dal loro effetto negativo sulla digeribilità se utilizzati a dosi non corrette. Considerando ciò, l’obiettivo di questo studio è stato quello di identificare il composto attivo di origine vegetale più promettente e di valutarne l’incapsulamento in un sistema di nanoliposomi per ridurne la tossicità e aumentarne l’attività. È stato effettuato uno screening per valutare la concentrazione minima inibitoria (MIC) dei seguenti composti identici naturali (NIC): nerolidolo, geraniolo, D-carvone, β-cariofillene, α-pinene, p-cimene, eucaliptolo, β-pinene, R-limonene, curcumina e quercetina. I risultati hanno indicato che il nerolidolo, il geraniolo e la curcumina avevano la più alta attività antimicrobica. Tuttavia, la valutazione della loro citotossicità (su linea cellulare MDBK) e dell’attività emolitica (su sangue di pecora defibrinato) ha rivelato che erano i composti più tossici. Tenendo conto di ciò, nonché delle caratteristiche intrinseche dei diversi composti, il progetto è proseguito con l’incapsulamento del nerolidolo. In particolare, la sospensione di nanoliposomi utilizzata per incapsulare il nerolidolo aveva una concentrazione di 5000 µg/mL; ma è stato impiegato un rapporto di carico dell’1%, il che significa che il nerolidolo rappresentava l’1% della concentrazione totale di nanoliposomi (5 g/L). L’attività antimicrobica dei nanoliposomi non caricati (UN), dei nanoliposomi caricati (LN) e del nerolidolo in forma libera è stata valutata utilizzando il metodo del Time-kill. I punti temporali sperimentali corrispondevano ai tempi medi di ritenzione nei diversi segmenti gastrointestinali degli animali monogastrici: 2, 4, 6 e 24 ore. I risultati hanno confermato che il nerolidolo libero ha mantenuto i risultati della MIC, mostrando attività solo contro batteri Gram-positivi, in particolare Enterococcus faecium, anche a basse concentrazioni, in ogni punto. Le formulazioni a base di nanoliposomi, tuttavia, hanno dimostrato attività contro tutti i batteri testati. Sia LN che UN hanno mostrato un’attività antimicrobica dipendente dal tempo e dalla dose, con attività simili alle concentrazioni più alte testate contro S. Typhimurium (a 24 ore) e contro MRSA ed E. coli (a 6 ore). Nel complesso, questi risultati suggeriscono che il vettore di nanoliposomi possiede un’attività antimicrobica propria, probabilmente dovuta al meccanismo di fusione della membrana. Inoltre, l’inclusione di nerolidolo non aumenta l’attività antimicrobica della formulazione, probabilmente a causa della limitata quantità di nerolidolo caricato. La citotossicità di UN e LN è stata valutata utilizzando gli stessi metodi di screening, ma in aggiunta è stato valutato il loro effetto sulla linea cellulare IPEC-J2. Sia LN che UN hanno mostrato citotossicità dipendente dalla dose, con le cellule IPEC-J2 più sensibili. Inoltre, LN ha dimostrato una tossicità più elevata rispetto a UN, a causa della presenza di nerolidolo. Di conseguenza, considerando tutti i risultati, sia LN che UN hanno mostrato un’interessante attività antimicrobica, nella maggior parte dei casi con attività simile. La terza parte dello studio si è concentrata sull’uso di LN e UN a una dose teoricamente equivalente in vivo di 100 g per 100 kg, corrispondente allo 0,1% del substrato, per valutare la loro influenza sulla digeribilità dei nutrienti in vitro. La digeribilità della sostanza secca (DMD), delle proteine grezze (CPD) e delle fibre detergenti neutre (NDFD) è stata valutata utilizzando metodologie specifiche per bovini e suini. In particolare, DMD e CPD sono state valutate alla fine di ogni fase di digestione per entrambi i modelli. Un sistema multi-enzimatico è stato utilizzato per entrambe le metodologie di digeribilità; inoltre, per i bovini, il fluido ruminale è stato utilizzato come inoculo per la digestione ruminale. I risultati non hanno mostrato differenze nella DMD e nella CPD per entrambi i modelli. Inoltre, LN ha depresso la NDFD a 48 ore di fermentazione, indicando una possibile riduzione della produzione di metano. Al contrario, per la determinazione della NDFD nel modello suino, è stato utilizzato un inoculo di liquido cecale per l’ultima fase della fermentazione in vitro, ma non sono state osservate differenze tra LN e UN. In conclusione, il nerolidolo in forma libera è emerso come il composto di origine vegetale con le proprietà antimicrobiche più promettenti, sebbene limitate ai batteri Gram-positivi, ma con elevata citotossicità. L’incapsulamento in un sistema di nanoliposomi all’1% di una concentrazione di 5000 µg/mL ha portato a una formulazione con attività antimicrobica ad ampio spettro, molto simile a UN, soprattutto dopo 6 ore. Tuttavia, la presenza di nerolidolo ha aumentato la citotossicità nella formulazione LN. Entrambe le formulazioni non hanno influenzato negativamente la DMD o la CPD nei bovini o nei suini, sebbene sia stata osservata una riduzione della NDFD a 48 ore nei bovini con LN. La formulazione LN mostra interessanti effetti antimicrobici e anti-metani, senza influenzare la digeribilità degli alimenti. Tuttavia, ulteriori studi in vivo sono necessari per valutare le applicazioni pratiche di questi prodotti nei sistemi di allevamento.