Sviluppo di strategie innovative per il controllo delle malattie da infezione: valutazione di trattamenti antimicrobici attraverso modelli di biofilm microbici e ingegnerizzazione di lieviti produttori di RNA interferenti per il controllo delle malattie a trasmissione vettoriale

Infectious diseases, including vector-borne diseases, represent an increasingly complex and critical challenge for global public health, primarily due to the growing spread of drug resistance in microorganisms and insecticide resistance in arthropods. This phenomenon, closely related to the improper and intensive use of antimicrobials and insecticides, accelerates the evolution and the selection of resistant strains, progressively reducing the efficacy of available therapies and complicating efforts to control the spread of vector-borne infections. Microbial drug resistance is further intensified by the ability of microorganisms to adhere to body surfaces but also implants and prostheses surfaces, forming biofilms. These structurally and functionally organized microbial communities are intrinsically more resistant to the actions of the immune system and antimicrobials. Biofilm-associated infections are therefore often chronic, difficult to treat, and become even more problematic when supported by drug-resistant microorganisms. This doctoral thesis presents the results of studies conducted to address the issues related to resistance phenomena, both to conventional antimicrobials and to insecticides, with the aim of developing innovative strategies for the control of infectious diseases. To develop new therapeutic strategies against biofilm-producing microorganisms, including drug-resistant bacteria, the activity of two synthetic antibody-derived peptides, K10T-TT and L18R, was evaluated against biofilm models developed on different surfaces. Specifically, the activity of K10T-TT was assessed against isolates of Escherichia coli producing extended-spectrum beta-lactamases, resistant to third-generation cephalosporins, and capable of forming biofilms on stainless steel, a material commonly used in orthopedic prostheses. The activity of L18R was evaluated against monomicrobial and polymicrobial biofilms formed by Enterococcus faecalis, frequently associated with endodontic infections, and Candida albicans, an opportunistic pathogen found in the oral cavity. These assays employed biofilm models formed on hydroxyapatite surfaces, which simulate dental enamel, or on composite resins commonly used in the fabrication of prosthetic crowns affixed to dental implants. To assess the potential positive effect of L18R on peri-implant tissue regeneration, its potential stimulatory effects on human gingival fibroblasts (HGF1) adhering to these resins were also examined. To develop innovative strategies for the control of vector-borne infectious diseases, an RNA-mediated gene-silencing system was produced and evaluated for the potential capability to silence specific genes responsible for resistance in arthropods, thereby restoring insecticide sensitivity, or to inhibit essential genes for growth and development. Specifically, Saccharomyces cerevisiae was engineered as a production and delivery system for interfering RNAs capable of silencing chitin synthase (chs) genes, which are recognized in the literature as resistance-associated in Culex mosquitoes, a vector widespread in Mediterranean regions. The results obtained from both lines of research demonstrate the potential of these strategies in managing infections associated with microbial biofilms and vector-borne diseases, establishing the foundation for further studies aimed at developing alternatives to conventional antimicrobial treatments and current vector-borne disease control strategies.

Le malattie da infezione, incluse quelle a trasmissione vettoriale, costituiscono una sfida sempre più complessa e critica per la sanità pubblica globale, principalmente a causa della crescente diffusione di farmacoresistenze nei microrganismi e di resistenze agli insetticidi negli artropodi. Questo fenomeno, strettamente correlato all’uso improprio e intensivo di antimicrobici e insetticidi, accelera l’evoluzione e la selezione di ceppi resistenti, riducendo progressivamente l’efficacia delle terapie disponibili e complicando il controllo della diffusione delle infezioni trasmesse da artropodi. Il fenomeno della farmacoresistenza microbica è ulteriormente aggravato dalla capacità dei microrganismi di aderire alle superfici corporee e alle superfici di impianti e protesi, formando biofilm, comunità microbiche strutturalmente e funzionalmente organizzate, intrinsecamente più resistenti all’azione del sistema immunitario e degli antimicrobici. Le infezioni biofilm-correlate sono quindi spesso croniche e difficili da trattare e ulteriormente problematiche quando sostenute da microrganismi farmacoresistenti. Nella presente tesi di dottorato sono presentati i risultati di studi condotti per affrontare le problematiche connesse ai fenomeni di resistenza sia ad antimicrobici convenzionali sia agli insetticidi, con l’obiettivo di sviluppare strategie innovative per il controllo delle malattie da infezione. Per sviluppare nuove strategie terapeutiche nei confronti di microrganismi produttori di biofilm, inclusi batteri farmaco resistenti, è stata valutata l’attività di due peptidi sintetici di derivazione anticorpale, K10T-TT e L18R, nei confronti di modelli di biofilm sviluppati su diverse superfici. In particolare, l’attività di K10T-TT è stata valutata nei confronti di isolati di Escherichia coli produttori di β-lattamasi a spettro esteso, resistenti a cefalosporine di terza generazione, in grado di formare biofilm su acciaio inossidabile, materiale comunemente impiegato nelle protesi ortopediche. L’attività di L18R è stata valutata nei confronti di biofilm monomicrobici e polimicrobici formati da Enterococcus faecalis, frequentemente associato ad infezioni endodontiche, e da Candida albicans, patogeno opportunista presente nel cavo orale. Per questi saggi sono stati utilizzati modelli di biofilm formati su superfici di idrossiapatite, in grado di simulare lo smalto dentale, o su resine composite comunemente impiegate nella realizzazione di corone protesiche da fissare agli impianti dentali. Per valutare il potenziale effetto positivo di L18R per la rigenerazione dei tessuti perimplantari, sono stati esaminati anche i suoi potenziali effetti stimolatori su fibroblasti gengivali umani (HGF1) aderenti alle stesse resine. Per sviluppare strategie innovative per il controllo delle malattie da infezione a trasmissione vettoriale è stato prodotto e valutato un sistema di silenziamento genico mediato da RNA potenzialmente in grado di silenziare specifici geni responsabili di resistenza negli artropodi, ripristinando la sensibilità agli insetticidi, oppure di inibire geni essenziali per crescita e sviluppo. In particolare, il lievito Saccharomyces cerevisiae è stato ingegnerizzato quale sistema di produzione e veicolazione di RNA interferenti in grado di silenziare i geni della chitina sintasi (chs), riconosciuti in letteratura come associati a resistenza nelle zanzare del genere Culex, un vettore molto diffuso nelle regioni del Mediterraneo. I risultati ottenuti nell’ambito di entrambe le linee di ricerca dimostrano il potenziale di queste strategie nella gestione delle infezioni associate a biofilm microbici e a quelle trasmesse da vettori, definendo le basi per ulteriori studi finalizzati allo sviluppo di alternative ai trattamenti antimicrobici convenzionali e alle attuali strategie di controllo delle malattie a trasmissione vettoriale.