Sviluppo e validazione di metodiche analitiche basate su polimeri ad impronta molecolare per la determinazione di Procalcitonina in matrici biologiche

La quantificazione della PCT in medicina umana rappresenta lo stato dell'arte per la diagnosi della sepsi, il monitoraggio della malattia e la gestione antimicrobica. Al contrario, gli studi clinici sulla rilevanza della PCT come predittore di sepsi nei pazienti veterinari sono pochi e limitati a cani e cavalli. Al momento, sono disponibili in commercio solo saggi immunologici ELISA per la determinazione di questo biomarcatore in specie animali che non sono completamente validati e sono utilizzabili a solo a scopo di ricerca. Obiettivo di questo progetto di tesi è stato quello di sviluppare metodiche analitiche innovative, per l’identificazione di PCT nelle specie veterinarie, mediante produzione di recettori mimetici, a base catecolamminica, basati sulla tecnologia dell’imprinting molecolare. I recettori biomimetici sviluppati sono stati applicati con successo nello sviluppo di due biosensori ottici antibody-free per il rilevamento in tempo reale di PCT equina e PCT canina. La dopamina (DA) e la norepinefrina (NE) sono state utilizzate come monomeri per la sintesi del MIP sulla superficie d’oro del chip SPR (Risonanza Plasmonica di Superficie) ed è stata confrontata l'efficienza di imprinting della proteina canina ed equina in termini di affinità di legame verso l'analita, selettività e sensibilità. Successivamente, sulla base del kit ELISA presenti in commercio, è stato sviluppato un nuovo saggio biomimetico immunoenzimatico di tipo sandwich (BELISA), sostituendo l'anticorpo di cattura del kit con il MIP a base di PNE. Il recettore biomimetico è stato colato direttamente sui pozzetti delle micropiastre, ottenendo notevoli vantaggi in termini di facilità e velocità di preparazione, basso costo e stabilità della temperatura. The quantification of PCT in human medicine represents the state of the art for the diagnosis of sepsis, the monitoring of disease and the antimicrobial stewardship. On the other hand, the clinical studies on the relevance of PCT as sepsis predictor in veterinary patients are few and limited to dogs and horses, notwithstanding the importance of an early detection of sepsis in veterinary patients too. At the present time, only ELISA immunoassays are commercially available for the determination of this biomarker in animal species that are not fully validated and useful only for research purpose. The aim of this study was to develop innovative analytical methods for the detection of PCT in veterinary species, through the production of catecholamine-based mimetic receptors, based on molecular imprinting technology. The biomimetic receptors have been successfully applied in the development of two antibody-free optical biosensors for the real-time detection of equine and canine PCT. Dopamine (DA) and norepinephrine (NE) were used as monomers for the synthesis of the MIP films on surface plasmon resonance (SPR) gold chips and the imprinting efficiency of canine and equine PCT in terms of binding affinity toward the analyte, selectivity, and sensitivity were compared. Subsequently, based on the commercially ELISA kit, was developed a new sandwich-type immunoenzymatic biomimetic assay (BELISA), by replacing the capture antibody of kit with the PNE-based MIP on the 96-well microplates. Significant advantages in terms of ease and speed of preparation, low cost and temperature stability was obtained.