Advancing Enzymatic Biocatalysis: Redesign of a Tyrosine Hydroxylase into a Peroxygenase and Biochemical Characterization of VatD halogenase for Sustainable Applications in Green Chemistry

Questa tesi di dottorato descrive la ricerca che ho condotto durante il mio dottorato nel laboratorio di Biologia Strutturale del Prof. Andrea Mattevi presso l'Università di Pavia, focalizzandosi sulla caratterizzazione e l'ingegnerizzazione di enzimi con potenziali applicazioni nel ramo della biocatalisi e della chimica verde. Il mio lavoro si è focalizzato su due sistemi enzimatici distinti: la caratterizzazione strutturale e biochimica di una tirosina idrossilasi batterica come modello per l'ingegneria enzimatica e lo studio di un'alogenasi flavina-dipendente (FDH) con un'inedita chemoselettività. La prima parte della mia ricerca, sviluppata in collaborazione con Zymvol Biomodelling e GECCO Biotech, aveva l'obiettivo di convertire un enzima contenente eme, nella prima perossigenasi aspecifica batterica (BUPO). Le perossigenasi aspecifiche (UPO), prodotte dai funghi, ossidano selettivamente legami C-H e C-C utilizzando il perossido di idrogeno sia come donatore di ossigeno che come riducente. Attraverso un approccio combinato di ingegneria computazionale e molecolare, siamo riusciti a trasformare una tirosina idrossilasi di *Streptomyces sclerotialus* in un BUPO funzionale. L'enzima mutante ottenuto, denominato MELA-TyrH, è in grado di catalizzare la conversione di indolo in indaco e di catalizzare una reazione di solfossidazione enantioselettiva, evidenziando il suo potenziale come biocatalizzatore ossidativo per la sintesi organica, il metabolismo dei farmaci e la biorisanificazione. La seconda parte di questa tesi si concentra sulla diversità strutturale e meccanicistica delle alogenasi flavina-dipendenti (FDH), enzimi fondamentali per l'alogenazione selettiva di molecole organiche, un processo chiave nella biosintesi di prodotti naturali bioattivi e composti farmaceutici. In collaborazione con la Prof.ssa April Lukowski (UC San Diego), abbiamo caratterizzato un'alogenasi specifica per alchini, VatD, omologa dell'enzima AetF, che mostra un'inedita chemoselettività per alchini terminali. Integrando approcci di biologia strutturale ed enzimologia, questa ricerca fornisce nuove informazioni sulla potenziale funzione di VatD, ed espandendo l’orizzonte sulle applicazioni delle FDH come biocatalizzatori ecocompatibili per la sintesi di blocchi costitutivi alogenati. Questi studi contribuiscono all'avanzamento dell'ingegneria enzimatica, dimostrando come la comprensione strutturale e meccanicistica possa guidare lo sviluppo di nuovi biocatalizzatori per applicazioni industriali, farmaceutiche e di chimica verde.

Biocatalysis offers a powerful approach to sustainable chemical transformations, providing selectivity, efficiency, and environmental benefits over traditional chemical processes. This thesis presents two complementary research endeavors that explore the potential of bacterial enzymes in oxidation and halogenation reactions, with implications for biocatalysis, green chemistry, and pharmaceutical synthesis. The first part of this work focuses on the structural and biochemical characterization of a bacterial tyrosine hydroxylase from Streptomyces sclerotialus, investigated as a template for enzyme engineering. Through computational modeling and iterative mutagenesis, this study successfully converted this heme-dependent enzyme into the first bacterial unspecific peroxygenase (BUPO), an unprecedented breakthrough. Unlike their fungal counterparts, bacterial UPOs had never been identified before. The engineered quadruple mutant, MELATyrH, efficiently catalyzes indole-to-indigo conversion and enantioselective sulfoxidation, demonstrating its potential in oxidative biotransformations. This work, developed in collaboration with Zymvol Biomodelling and GECCO Biotech, underscores the power of protein engineering in expanding the catalytic repertoire of bacterial enzymes for industrial applications. The second part of this research investigates the structural and mechanistic diversity of flavin-dependent halogenases (FDHs), with a particular focus on VatD, a homologue of the well-characterized AetF. VatD represents a unique clade of alkynyl halogenases, displaying unprecedented chemoselectivity for terminal alkynes. By integrating structural biology and enzymology, in collaboration with Prof. April Lukowski (UC San Diego), this study elucidates the functional divergence of VatD, shedding light on its potential for regio- and stereoselective halogenation in biotechnological applications. FDHs, as versatile biocatalysts, offer a sustainable alternative to hazardous halogenation methods in pharmaceutical and fine chemical synthesis. Together, these studies contribute to expanding the biocatalytic toolbox, demonstrating how enzyme engineering and structural characterization can unlock novel functionalities in bacterial oxidases and halogenases. By harnessing these enzymes, this work paves the way for more efficient and eco-friendly bioprocesses in industrial biotechnology.