Zincophore-based metal transport

Rapidly spreading antimicrobial resistance is a serious problem and a global threat to the modern society. Treatment of bacterial and fungal infections with drugs that have been effective so far turns out to be impossible in many cases. Therefore, to design a highly specific antimicrobial drug, it is necessary to understand the difference in human and pathogen metabolism. One of the main differences is based on the mechanism of Zn(II) uptake, which is one of the key aspects of their virulence and survival. In response to infections occurring in the host cell, defense strategies are used such as lowering the concentration of free metal, which allows limiting its access to pathogen cells. By competing with the host organism for metal ions necessary for survival, bacteria and fungi have developed mechanisms that enable them to absorb them from the host's environment. These include, among others, the production of proteins with a high affinity for metal ions. The main goal of this doctoral dissertation was to understand the bioinorganic chemistry of Zn(II) complexes with selected unstructured fragments of zincophores and Zn(II) transporters present in the organisms of fungi and bacteria. In my work, I focused on fragments of five different proteins involved in Zn(II) transport: (i) Aspf2 and (ii) ZrfC from Aspergillus fumigatus, (iii) ZnuA and (iv) AztC from Paracoccus denitrificans and (v) AdcA from Streptococcus mutans. All tested ligands met three criteria: (i) they are located in unstructured fragments of proteins, (ii) they have amino acid residues that are able to bind the analyzed metal ions, and (iii) they are located in evolutionarily conserved places. Bearing in mind that Ni(II) is necessary for the proper functioning and development of pathogens and may compete for binding sites with Zn(II), I also decided to determine the preferences of the analyzed fragments towards this metal ion. In my work, in order to have a better understanding of the preferred metal sites, I also focused on the characterization of the thermodynamic properties of two model sequences: Ac-ACHA-NH2 and Ac-AHCA-NH2. To carry out the physicochemical and thermodynamic characterization of the studied unstructured protein fragments involved in Zn(II) transport and their complexes, I used a number of complementary experimental methods: mass spectrometry, potentiometric titration, UV-Vis, CD and NMR spectroscopy. I carried out parts of the work under the supervision of prof. Maurizio Remelli at the University of Ferrara. For all the studied systems, I determined the most probable coordination sites for Zn(II) and Ni(II) ions. I characterized the donor atoms involved in their coordination depending on the pH value of the tested solution and deciphered the geometry of the resulting Ni(II) complexes. Among the analyzed fragments, I determined the ligands that have the highest affinity for the analyzed metal ions, and determined the most effective coordination modes. For Zn(II) these are the (i) {2Nim, 2S-} and (ii) {4Nim} coordination modes, the second one with a polymorphic motif. While for Ni(II), the most effective binding modes turned out to be: (i) the {6Nim} and (ii) the {2Nim, 2S-} type of coordination. Additionally, basing on the precisely calculated stability constants, I showed that the transport of Zn(II) from the zincophore Aspf2 to the ZrfC transporter present in Aspergillus fumigatus is possible. This result is particularly interesting because it makes a huge contribution to understanding the bioinorganic chemistry of Zn(II) transport in pathogens. In the future, my findings may serve as a starting point for designing new, highly selective antimicrobial drugs based on STAMP technology. The indicated protein fragments with the highest affinity for Zn(II) are excellent examples of targeting domains that, connected with a drug substance by a flexible linker, ensure selective accumulation of the drug molecule near the pathogen.

La rapida diffusione della resistenza antimicrobica rappresenta un serio problema e una minaccia globale per la società moderna. Il trattamento delle infezioni batteriche e fungine con farmaci finora efficaci risulta in molti casi impossibile. Per progettare un farmaco antimicrobico efficace, è necessario comprendere le differenze tra il metabolismo umano e patogeno. Una delle principali differenze si basa sul meccanismo di assorbimento dello Zn(II), il quale costituisce un punto chiave per la virulenza e sopravvivenza del patogeno. In seguito all’instaurarsi di un’infezione nella cellula ospite, l’organismo risponde riducendo la concentrazione di metallo libero, privandone così l’assorbimento da parte del patogeno. Questi, necessitando di ioni metallici per la loro sopravvivenza, hanno sviluppato meccanismi di acquisizione che permette loro di assorbirli dall’ambiente dell’ospite, entrando in competizione con quest’ultimo. Tra i vari meccanismi, vi è la produzione di proteine ad alta affinità per gli ioni metallici. Lo scopo principale di questa tesi di dottorato è comprendere la chimica bioinorganica dei complessi di Zn(II) con frammenti non strutturati selezionati di zincofori e trasportatori di Zn(II) presenti negli organismi di funghi e batteri. Sono stati studiati frammenti di cinque diverse proteine coinvolte nel trasporto di Zn(II): (i) Aspf2 e (ii) ZrfC da Aspergillus fumigatus, (iii) ZnuA e (iv) AztC da Paracoccus denitrificans e (v) AdcA da Streptococcus mutans. Tutti i ligandi testati soddisfano tre criteri: (i) sono localizzati in frammenti non strutturati di proteine e (ii) in posizioni evolutivamente conservate, (iii) presentano residui amminoacidici in grado di legare gli ioni metallici studiati. Considerando che il Ni(II) è necessario per il corretto funzionamento e sviluppo dei patogeni e che può competere con lo Zn(II) per i siti di legame, è stata anche determinata la preferenza dei frammenti analizzati verso di esso. Sono state inoltre studiate le proprietà termodinamiche di due sequenze modello: Ac-ACHA-NH₂ e Ac-AHCA-NH₂, con lo scopo di indagare quali sono i siti metallici preferiti. Per effettuare la caratterizzazione fisico-chimica e termodinamica dei frammenti proteici non strutturati, coinvolti nel trasporto dello Zn(II) e dei loro complessi, ho utilizzato diversi metodi sperimentali: spettrometria di massa, titolazione potenziometrica, spettroscopia UV-Vis, CD e NMR. Ho svolto parte del lavoro sotto la supervisione del Prof. Maurizio Remelli presso l'Università di Ferrara. Per tutti i sistemi studiati, ho determinato: i siti di coordinazione più probabili per gli ioni Zn(II) e Ni(II), gli atomi donatori coinvolti nella loro coordinazione in base al pH della soluzione e la geometria dei complessi di Ni(II) risultanti. Sono stati poi individuati i ligandi con la maggiore affinità per gli ioni metallici e le modalità di coordinazione più efficaci. Per lo Zn(II), i modi di coordinazione sono: (i) {2Nim, 2S-} e (ii) {4Nim}, quest'ultima con un motivo polimorfico. Mentre per il Ni(II), i modi di legame più efficaci sono: (i) la modalità di coordinazione {6Nim} e (ii) {2Nim, 2S-}. Inoltre, basandomi sulle costanti di stabilità calcolate con precisione, ho dimostrato che il trasporto di Zn(II) dallo zincoforo Aspf2 al trasportatore ZrfC presente in Aspergillus fumigatus è possibile. Questo risultato è interessante perché fornisce un enorme contributo alla comprensione della chimica bioinorganica del trasporto di Zn(II) nei patogeni. In futuro, i miei risultati potrebbero servire come punto di partenza per la progettazione di nuovi farmaci antimicrobici selettivi basati sulla tecnologia STAMP. I frammenti proteici indicati, con la più alta affinità per lo Zn(II), sono eccellenti esempi di domini di targeting che, collegati a un principio attivo tramite un linker flessibile, garantiscono l'accumulo selettivo della molecola di farmaco in prossimità del patogeno.