Development of novel strategies for measuring extracellular ATP dynamics

Purinergic signaling represents a sophisticated cellular response mechanism mediated by purine compounds, particularly ATP, ADP, UDP, and adenosine. This signaling pathway plays a crucial role in various physiological processes, allowing cells to communicate and respond effectively to changes in their environment. Extracellular ATP plays a central role in purinergic signaling and inflammation, influencing several physiological and pathological processes. As a key inflammatory signaling molecule and precursor of the immunosuppressive adenosine, extracellular ATP is involved in critical mechanisms in the central nervous system, tumor microenvironment, immune cell maturation, and the onset of sepsis, among others. This highlights the need for reliable tools to measure extracellular ATP in vitro and, more importantly, in vivo, to better understand its involvement in health and disease. This thesis presents two innovative systems for measuring extracellular ATP: the pmeLUC/nilla ratiometric probe and a nanobody-luciferase construct. pmeLUC/nilla is an improvement of the widely used pmeLUC probe and consist of a bicistronic vector containing two luciferases, the pmeLUC and the Renilla luciferase separated by an IRES element. The pmeLUC/nilla allows the normalized measurement of extracellular ATP, thus it is independent from transfection efficiency and expression levels. Thanks to this feature this system enables a more accurate measurement of extracellular ATP in several research contexts. The second system is a nanobody-luciferase construct that targets the P2X7 receptor and has shown promising results for in vitro ATP detection. The construct named 7E2opt-dim-lucYY5 demonstrated high specificity for HEK-293 cells expressing murine P2X7 and provided reliable luminescence readings, dependent on ATP concentration. This system offers substantial advantages over the other probes for ATP detection because it does not require transfection being a ready-to-use tool. It will be further characterized for an in vivo use. Together, these systems provide substantial advancements in extracellular ATP measurement, with potential applications in cancer biology, immunology, and broader fields of biomedical research. Ultimately, these tools may contribute to the ambitious goal of mapping extracellular ATP fluctuations throughout the body, facilitating deeper insights into its role in health and disease.

La segnalazione purinergica rappresenta un sofisticato meccanismo di risposta cellulare mediato dalle purine, tra le quali ATP, ADP, UDP e adenosina. Questo sistema di segnalazione svolge un ruolo decisivo in numerosi processi fisiologici, consentendo alle cellule di comunicare e rispondere in modo efficiente agli stimoli esterni. In particolare, l'ATP extracellulare riveste una funzione centrale nella segnalazione purinergica e nei processi infiammatori da essa mediata, regolando sia fenomeni fisiologici che patologici. In quanto molecola chiave della risposta infiammatoria e precursore dell'adenosina, un potente agente immunosoppressivo, l'ATP extracellulare è coinvolto in numerosi meccanismi nell’ambito del sistema nervoso centrale, della maturazione delle cellule immunitarie, del microambiente tumorale e della sepsi. Da tale premessa nasce la necessità di disporre di strumenti affidabili per misurare l'ATP extracellulare in vitro e soprattutto in vivo, per comprendere meglio il suo ruolo fisiologico e patologico. Questa tesi presenta due sistemi innovativi per la misurazione dell'ATP extracellulare: la sonda raziometrica pmeLUC/nilla e un costrutto nanobody-luciferasi. La pmeLUC/nilla rappresenta un'evoluzione della sonda pmeLUC, ormai largamente utilizzata, e consiste in un vettore bicistronico contenente due luciferasi, la pmeLUC e la Renilla luciferasi, separate da un elemento IRES. Questo sistema permette la misurazione normalizzata dell'ATP extracellulare, risultando indipendente dall'efficienza di trasfezione e dai livelli di espressione e garantendo una maggiore accuratezza in diversi contesti sperimentali. Il secondo sistema descritto, un costrutto nanobody-luciferasi, è stato progettato in modo da legare il recettore P2X7 e ha prodotto risultati promettenti per la rilevazione dell’ATP extracellulare in vitro. Il costrutto denominato 7E2opt-dim-lucYY5 ha mostrato elevata specificità per le cellule HEK-293 che esprimono il recettore P2X7 murino, permettendo di correlare accuratamente la luminescenza emessa alla concentrazione di ATP. Questo sistema presenta un notevole vantaggio rispetto ad altre sonde per la misurazione dell'ATP, in quanto non richiede trasfezione ed è pronto all'uso. Inoltre, si programma in futuro di testare questa sonda in vivo. Complessivamente, questi due sistemi rappresentano un importante progresso nella misurazione dell'ATP extracellulare, con potenziali applicazioni nel campo dell'oncologia, dell'immunologia e in genere nella ricerca biomedica. Questi strumenti potrebbero contribuire all'ambizioso progetto di mappare le fluttuazioni dell'ATP extracellulare nell'organismo, offrendo nuove prospettive per comprendere più a fondo il suo ruolo nei processi fisiologici e patologici.