Isolation, characterisation and biological evaluation of Apple-derived extracellular vesicles

Introduction and Scope: Extracellular vesicles (EVs) are small membrane-bound particles released by cells, playing critical roles in intercellular communication. Recent studies have expanded the understanding of EVs beyond animal models to plant sources, including apples (Malus domestica). This thesis explores the isolation and molecular composition of apple-derived extracellular vesicles (ADEVs), focusing on their potential for application in biotechnology and human health. Materials and Methods: ADEVs isolated from whole apples were characterized for size, morphology and molecular markers. Comprehensive profiling of ADEVs cargo was achieved through proteomic, lipidomic, and miRNA analyses, revealing how their composition varies with apple cultivar and cultivation methods, and how it can affect ADEVs biological effect on mammalian cells. This thesis also investigates the functional properties of ADEVs, particularly their interactions with human cells in vitro. The biological effects of ADEVs on immune cells were investigated by examining their role in inflammation and immunomodulation, focusing specifically on their ability to influence human macrophage polarization. Further investigation explored ADEVs' influence on the interaction between macrophages and mesenchymal stem cells (MSCs) during osteoblast differentiation, evaluating whether ADEV-driven immunomodulation has broader implications for tissue regeneration. The regenerative potential of ADEVs was also examined in human dermal fibroblasts (hDFs), by investigating ADEV-mediated changes in inflammation signalling, ECM production and oxidative stress. In addition, ADEVs’ antimicrobial effects were tested on skin and intestinal microorganisms, providing insights into their potential role in enhancing skin health via microbiota modulation. Finally, ADEV biocompatibility and release kinetics were evaluated using hyaluronic acid (HA) based biomaterials to assess a potential pathway for ADEV delivery in medical applications. Results and Discussion: ADEVs' size and molecular markers suggest they primarily originate as MVB-derived exosomes. The presence of antioxidant enzymes along with bioactive lipids indicates a role in countering oxidative stress, while miRNA content suggests potential anti-inflammatory effects. Functionally, ADEVs demonstrated immunomodulatory benefits by promoting a shift in human macrophages from a pro-inflammatory to an anti-inflammatory state via inhibition of the TLR4/NF-κB pathway. In support of bone regeneration, ADEVs were shown to enhance MSC differentiation into osteoblasts through macrophage-mediated effects, support angiogenesis, and regulate bone remodelling enzymes. In dermal applications, ADEVs reduced inflammation in hDFs by downregulating NF-κB signalling, decreased oxidative stress, and stabilized the ECM by modulating the expression of Col I, Col III, and MMPs. ADEVs also displayed selective antimicrobial activity, inhibiting the growth of opportunistic pathogens while promoting beneficial microorganisms in the skin and gut, suggesting their use as prebiotics for health management. This study further uncovered that ADEVs trigger calcium signalling in hDFs, indicating calcium mediated pathways as part of their bioactivity. Finally, ADEVs were compatible with HyA-based biomaterials, particularly MeHA patches, which could serve as an effective delivery system combining the therapeutic properties of both components. Conclusions: In conclusion, this thesis underscores the potential of ADEVs across medical, nutraceutical, and cosmetic applications, with promise in regenerative, anti-inflammatory, antioxidant, and antimicrobial therapies. These findings lay a foundation for future research to fully explore and optimize ADEV-based interventions, contributing to innovative solutions for a range of health and wellness challenges.

Introduzione: Le vescicole extracellulari (EVs) sono piccole particelle delimitate da membrana, rilasciate dalle cellule e coinvolte in processi di comunicazione intercellulare. Studi recenti ne hanno ampliato la comprensione, includendo fonti vegetali come le mele (Malus domestica). Questa tesi esplora l'isolamento e la composizione molecolare delle EVs derivate dalla mela (ADEVs), concentrandosi sul loro potenziale per applicazioni biotecnologiche e nella salute umana. Materiali e Metodi: Le ADEVs, isolate da mele intere, sono state caratterizzate per dimensione, morfologia e marcatori molecolari. Il loro contenuto è stato analizzato tramite studi proteomici, lipidomici e di miRNA, evidenziando variazioni legate ai metodi di coltivazione. Questa tesi analizza inoltre le proprietà funzionali delle ADEVs, in particolare le loro interazioni con le cellule umane in vitro. Gli effetti biologici sulle cellule immunitarie sono stati studiati esaminando il loro ruolo nell'infiammazione e nell'immunomodulazione, con particolare attenzione alla capacità di influenzare la polarizzazione dei macrofagi umani. È stato inoltre esplorato il loro effetto sull'interazione tra macrofagi e cellule staminali mesenchimali (MSCs) durante la differenziazione osteoblastica, valutando il potenziale delle ADEVs nella rigenerazione tissutale. Il potenziale rigenerativo delle ADEVs è stato analizzato anche nei fibroblasti dermici umani (hDFs), studiando le modifiche mediate dalle ADEVs nei segnali infiammatori, nella produzione della matrice extracellulare (ECM) e nello stress ossidativo. Inoltre, sono stati testati gli effetti antimicrobici delle ADEVs su microrganismi della pelle e dell'intestino, per valutare il loro ruolo nel migliorare la salute della pelle tramite la modulazione del microbiota. Infine, la biocompatibilità e la cinetica di rilascio delle ADEVs sono state analizzate utilizzando biomateriali a base di acido ialuronico (HA), per valutare un possibile sistema di somministrazione in applicazioni mediche. Risultati e Discussione: Le dimensioni e i marcatori molecolari delle ADEVs suggeriscono che esse originino dai corpi multivescicolari. La presenza di enzimi antiossidanti e lipidi bioattivi indica un ruolo nella protezione dallo stress ossidativo. Dal punto di vista funzionale, le ADEVs hanno dimostrato proprietà immunomodulatorie, favorendo la transizione dei macrofagi umani da uno stato pro-infiammatorio a uno antinfiammatorio attraverso l'inibizione della via TLR4/NF-κB. Nel contesto della rigenerazione ossea, le ADEVs hanno mostrato di favorire la differenziazione delle MSCs in osteoblasti tramite effetti mediati dai macrofagi, supportare l'angiogenesi e regolare gli enzimi coinvolti nel rimodellamento osseo. Nelle applicazioni dermiche, le ADEVs hanno ridotto l'infiammazione nei fibroblasti dermici umani abbassando l'attivazione della via NF-κB, ridotto lo stress ossidativo e stabilizzato la matrice extracellulare regolando l'espressione di Col I, Col III e MMPs. Le ADEVs hanno inoltre mostrato attività antimicrobica selettiva, inibendo la crescita di patogeni opportunisti e promuovendo quella di microrganismi benefici per la pelle e l’intestino, suggerendo un potenziale utilizzo come prebiotici per la gestione della salute. Lo studio ha inoltre rivelato che le ADEVs attivano la segnalazione del calcio nei fibroblasti dermici, indicando il coinvolgimento di vie di segnalazione calcio-mediate nella loro bioattività. Infine, le ADEVs si sono dimostrate compatibili con biomateriali a base di HA, in particolare con patch di MeHA, suggerendo un efficace sistema di rilascio. Conclusioni: Questa tesi evidenzia il potenziale delle ADEVs in applicazioni mediche, nutraceutiche e cosmetiche, con prospettive promettenti nelle terapie rigenerative, antinfiammatorie, antiossidanti e antimicrobiche. I risultati forniscono una base per future ricerche volte a ottimizzare l’uso delle ADEVs per la salute e il benessere.