Preclinical study of an innovative combined therapy in a colorectal cancer cell line

Colorectal cancer (CRC) is one of the most common cancers, ranking number three worldwide, associated with the second highest cancer-related mortality. In more than half of CRC cases it was observed a multi-step process leading to malignant transformation, that is, the cells of the intestinal epithelium accumulate a series of successive mutations, that slowly alters their morphological features. The first mutation occurs in the Adenomatous Polyposis Coli tumor-suppressor gene, that causes a condition called adenomatous polyposis affecting the large intestine. As more mutations accumulate, the cells of the intestinal polyps transform into carcinoma cells. At late stages, CRC also presents an aggressive metastatic profile, that makes it complicated to manage. The first line treatment for early-stage CRC is resection (where feasible) that can be associated with adjuvant chemotherapy/radiotherapy. For non-resectable metastatic tumors, chemotherapy is chosen to reduce symptoms, aggressiveness and extension of the tumor mass; in some oligometastatic CRCs, these therapies can lead to elimination/reduction of metastases, after which the patient is subjected to maintenance therapy. Given the broad spectrum of stages of the disease, and the presence of non-responding/relapsing patients, there is a clinical need for novel therapies. In this context, the present study aims at evaluating the effects of the antitumoral human recombinant protein TRAIL (TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand) in combination with a natural extract from turmeric, Curcumin, on the human CRC cell line HCT116. In particular, the study is focused on the induction of cell death through the extrinsic and intrinsic apoptotic pathways. HCT116 cells were treated with two different concentrations of Curcumin (12,5 μM and 8 μM), TRAIL 500 ng/mL and their combinations. TRAIL alone was able to significantly induce apoptosis and reduce cell viability at 24 and 48 hours, but TRAIL+Curcumin 12,5 μM was more effective than TRAIL or Curcumin 12,5 μM alone, demonstrating the potential benefit of associating antitumoral TRAIL with this turmeric extract. The induction of apoptosis was confirmed by the protein analysis of cellular apoptotic markers, and further analyses revealed modulation of pro-apoptotic (Caspase-3) and anti-apoptotic (phosphorylated STAT3, Bcl-2) proteins. In particular, the combined treatment TRAIL+Curcumin 12.5 μM showed higher effectiveness than TRAIL or Curcumin alone in inducing Caspase-3 activation and reducing p-STAT3 and Bcl-2, confirming the effectiveness of their combination. Moreover, Curcumin was able to modulate tumor suppressor proteins: in particular, Curcumin 12.5 μM increased the expression of p53 and p21, also in combination with TRAIL, that contribute to blocking tumor growth and sensitizing the cells to TRAIL activity. TRAIL also demonstrated the ability to elicit pyroptosis, an alternative cell death pathway characterized by cell swelling and rupture of the cellular membrane caused by formation of pores. Curcumin was able to potentiate this effect, increasing the level of pyroptosis, supported by the induction of a protein involved in the formation of pyroptotic pores, Gasdermin E. The results obtained demonstrate that the combination of these molecules leads to the activation of both extrinsic and intrinsic apoptotic pathways: this improves the tumor-killing properties of TRAIL, supported by the capability of Curcumin to block anti-apoptotic proteins while increasing activation of the tumor suppressors p53 and p21. Curcumin also sustains the pyroptotic response induced by TRAIL, an alternative pathway of induced cell death that contributes to the elimination of tumor cells, possibly avoiding classical mechanisms mediating tumor resistance to drugs. The combination of these two molecules may represent an optimal strategy to improve the antitumor effects and overcome tumor resistance to chemotherapeutic drugs in CRC.

Il cancro del colon-retto (CRC) è uno dei tumori con maggiore incidenza, al terzo posto a livello mondiale, e al secondo per tasso di mortalità legata al cancro. In più della metà dei casi di CRC è stato osservato un processo a più fasi che porta alla trasformazione maligna, ovvero le cellule dell'epitelio intestinale accumulano una serie di mutazioni, che lentamente alterano le loro caratteristiche morfologiche. La prima mutazione si verifica nel gene oncosoppressore APC, che causa una condizione chiamata poliposi adenomatosa che colpisce l'intestino crasso. Con l'accumularsi delle mutazioni, le cellule dei polipi intestinali si trasformano in cellule di carcinoma. Negli stadi più avanzati, il CRC presenta anche un profilo metastatico aggressivo, che ne rende complicata la gestione. Il trattamento di prima linea per il CRC in stadio precoce è la resezione che può essere associata a chemioterapia/radioterapia adiuvante. Per i tumori metastatici non resecabili, la chemioterapia viene scelta per ridurre i sintomi, l'aggressività e l'estensione della massa tumorale; in alcuni pazienti oligometastatici, queste terapie possono portare all'eliminazione/riduzione delle metastasi, dopodiché viene adottata una terapia di mantenimento. Dato l'ampio spettro di stadi della malattia e la presenza di pazienti non responsivi/recidivanti, vi è la necessità clinica di nuove terapie. In questo contesto, il presente studio si propone di valutare gli effetti della proteina umana ricombinante TRAIL (TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand) in combinazione con un estratto naturale di curcuma, la Curcumina, sulla linea cellulare di CRC umano HCT116. In particolare, lo studio si concentra sull'induzione della morte cellulare attraverso le vie apoptotiche estrinseca e intrinseca. Le cellule HCT116 sono state trattate con due diverse concentrazioni di Curcumina (12,5 μM e 8 μM), TRAIL e le loro combinazioni. Il solo TRAIL è in grado di indurre apoptosi e ridurre la vitalità cellulare dopo 24 e 48 ore, ma TRAIL+Curcumina 12,5 μM è stato più efficace di TRAIL o Curcumina 12,5 μM da soli (sia a 24 che a 48 ore), dimostrando il potenziale dell'associazione di TRAIL con questo estratto della curcuma. L'induzione dell'apoptosi è stata confermata dall'analisi proteica di marcatori cellulari di apoptosi e ulteriori analisi hanno rivelato la modulazione di proteine pro-apoptotiche (Caspasi-3) e anti-apoptotiche (STAT3 fosforilata, Bcl-2), confermando l'efficacia della loro combinazione. Inoltre, la Curcumina è stata in grado di modulare le proteine di geni oncosoppressori: in particolare, la Curcumina 12,5 μM ha aumentato l'espressione di p53 e p21, anche in combinazione con TRAIL, contribuendo a bloccare la crescita tumorale e a sensibilizzare le cellule all'attività di TRAIL. TRAIL ha dimostrato anche la capacità di causare piroptosi, un meccanismo alternativo di morte cellulare caratterizzata dal rigonfiamento delle cellule e dalla rottura della membrana cellulare causata dalla formazione di pori. La Curcumina è stata in grado di potenziare questo effetto, aumentando il livello di piroptosi, come dimostrato dall'analisi di una proteina coinvolta nella formazione dei pori, la Gasdermina E. I risultati ottenuti dimostrano che la combinazione di queste molecole porta all'attivazione delle vie apoptotiche estrinseca ed intrinseca: ciò migliora le proprietà antitumorali di TRAIL, supportate dalla capacità della Curcumina di bloccare le proteine anti-apoptotiche e di aumentare l'attivazione degli oncosoppressori p53 e p21. La Curcumina supporta anche la piroptosi indotta da TRAIL, che contribuisce all'eliminazione delle cellule tumorali, possibilmente raggirando i meccanismi che mediano la resistenza dei tumori ai farmaci. La combinazione di queste due molecole potrebbe rappresentare una strategia ottimale per migliorare gli effetti antitumorali e superare la resistenza del CRC ai farmaci chemioterapici.