Development of sustainable sanitation systems for infection control via stable modulation of the environmental microbiome

Background and aim of the research Confined built environments (BEs) have microbiomes dominated by human-derived microbes, increasing the indoor infection risk. Hospitals exemplify this dynamic, as their microbiomes are a source of human pathogens often resistant to antimicrobials (AMR), due to the continuous selective pressure exerted by disinfectants and antimicrobial drugs. Thus, hospital pathogens are associated with difficult-to-treat healthcare-associated infections (HAIs), posing a global concern. Besides AMR selection, chemical disinfectants also generally show short-term effectiveness and high environmental impact. To overcome these limitations, alternative strategies were recently considered for bioburden control. The approach we investigated (Probiotic Cleaning Hygiene System, PCHS), involves an eco-friendly detergent containing spores of Bacillus probiotics. PCHS was shown to reduce hospital pathogens by 80%, AMR by 99.9%, and HAIs by 52%, and to be also effective against enveloped viruses, like SARS-CoV-2. However, PCHS action is gradual and more addressed to prevention than immediate decontamination. Additionally, its effects in non-hospital crowded spaces and its long-term safety of use following prolonged contact with pathogens remained unexplored. To address these gaps, my PhD research aimed to: (1) obtain targeted and rapid decontamination, by adding bacteriophages to PCHS; (2) assess PCHS applicability in high-traffic mas transportation areas; (3) evaluate the stability and safety of PCHS-Bacillus strains after contact with hospital pathogens. Investigation methods 1) This was a pre-post study conducted in two Italian hospitals over 14 weeks subdivided in three phases based on the type of applied sanitation: 1) chemical disinfection; 2) PCHS; 3) PCHS with anti-staphylococcal phages (PCHSφ). Indoor microbial contamination was monitored using culture-based (RODAC plates) and molecular (qPCR) analyses. 2) This was a case-control study performed in Milan subways over 12 weeks, during which PCHS was compared with chlorine disinfection, by evaluating surface and air contamination by RODAC, qPCR, and NGS. 3) This study was conducted in collaboration with the University of Oxford and analysed 200 Bacillus isolates from PCHS-treated hospitals, by whole genome sequencing (WGS), to assess their whole resistome and virulome. Results/Conclusions 1) The addition of phages to PCHS (PCHSφ) significantly improved the reduction of target bacteria compared to PCHS alone (76% vs. 50%), without affecting Bacillus levels or non-target microbes. Notably, PCHSφ was not compatible with chlorine disinfection, which disrupted probiotics and phages. This suggests PCHSφ as an effective tool for rapid MDR pathogen reduction in healthcare environments. 2) In the subway study, PCHS significantly abated pathogens compared to chemical disinfectants, totally eliminating them in 12 weeks (-100%), also reducing their AMR by up to 2 logs. Additionally, PCHS lowered SARS-CoV-2 contamination by 60%, demonstrating its efficacy against bacterial, fungal, and viral threats. Notably, unlike hospital settings, subway microbiome remained largely stable, aside from reductions in pathogenic microbes. 3) Metagenomic analysis results allowed to confirm B. subtilis and B. velezensis as the dominant species in both the original PCHS detergent and treated hospitals, defining precisely the product species composition. Phylogenetic analysis and comparison between PCHS-Bacillus original species and hospital isolates confirmed their genetic stability, showing the absence of acquired resistance or virulence genes and supporting their long-term safety. Overall, the research highlights PCHS as a promising, sustainable alternative for infection control within a “One Health” framework.

Introduzione e scopo della ricerca Gli ambienti costruiti confinati (come gli ospedali), hanno microbiomi dominati da microbi umani che spesso sviluppano resistenza (AMR), a causa della pressione selettiva esercitata da disinfettanti e antimicrobici. Ciò provoca infezioni ospedaliere (ICA) di difficile trattamento. I disinfettanti mostrano inoltre un’efficacia limitata nel tempo e un elevato impatto ambientale. Per superare questi limiti, sono recentemente state sviluppate procedure di sanificazione alternative. L'approccio da noi studiato (Probiotic Cleaning Hygiene System, PCHS), prevede un detergente ecologico contenente spore di Bacillus probiotici, e ha dimostrato di ridurre i patogeni ospedalieri dell’80%, l’AMR del 99,9% e le ICA del 52%, oltre a inattivare i virus inviluppati. Tuttavia, la sua azione non è immediata ma graduale e aspecifica. Inoltre, mancano dati sui suoi effetti negli ambienti non sanitari e sulla sua sicurezza a lungo termine. Per investigare questi aspetti, il mio progetto di dottorato ha cercato di: 1) migliorare l’azione di decontaminazione rapida e specifica del PCHS; 2) valutare l'applicabilità del PCHS negli ambienti dei trasporti di massa; 3) valutare la sicurezza dei probiotici del PCHS dopo il contatto con agenti patogeni ospedalieri. Metodi di indagine Per i tre studi: 1) Studio pre-post condotto in due ospedali italiani per 14 settimane e suddiviso in tre fasi in base al tipo di igienizzazione applicata: 1) disinfezione chimica; 2) PCHS; 3) PCHS con fagi antistafilococco (PCHSφ). La contaminazione microbica indoor è stata monitorata utilizzando analisi colturali (piastre RODAC) e molecolari (qPCR). 2) Studio caso-controllo condotto nella metropolitana di Milano per 12 settimane, durante le quali il PCHS è stato confrontato con la disinfezione mediante cloro, valutando la contaminazione superficiale e aerogena mediante RODAC, qPCR e NGS. 3) Studio che ha analizzato 200 isolati di Bacillus provenienti da ospedali trattati con PCHS, mediante Whole Genome Sequencing (WGS), per valutare l’intero resistoma e viruloma degli isolati. Condotto in collaborazione con l'Università di Oxford. Risultati/conclusioni Per i tre studi: 1) L’aggiunta di fagi al PCHS (PCHSφ) ha aumentato significativamente la riduzione dei batteri bersaglio rispetto al solo PCHS (76% vs. 50%), senza modificare i livelli di Bacillus o dei microbi non target. In particolare, il PCHSφ non era compatibile con la disinfezione a base di cloro, che ha interrotto i probiotici e i fagi. Ciò suggerisce che il PCHSφ sia uno strumento efficace per la rapida riduzione del patogeno MDR negli ambienti sanitari. 2) L’applicazione di PCHS ha significativamente diminuito i patogeni rispetto ai disinfettanti chimici negli ambienti dei treni metropolitani, eliminandoli completamente in 12 settimane (-100%), e riducendo anche la loro AMR fino a 2 log. Inoltre, il PCHS ha ridotto la contaminazione da SARS-CoV-2 del 60%, dimostrando la sua efficacia non solo contro batteri e funghi, ma anche contro virus. A differenza di quanto osservato in ambiente ospedaliero, il microbioma complessivo della metropolitana è rimasto stabile, eccetto per la riduzione dei microbi patogeni. 3) I risultati dell'analisi metagenomica hanno permesso di confermare che B. subtilis e B. velezensis sono le specie dominanti sia nel detergente originale PCHS sia negli ospedali trattati, definendo con precisione la composizione delle specie del prodotto. L’analisi filogenetica e il confronto tra le specie originarie di PCHS-Bacillus e i corrispondenti isolati ospedalieri hanno confermato la loro stabilità genetica, dimostrando l’assenza di geni acquisiti di resistenza o virulenza e supportando la loro sicurezza a lungo termine. Nel complesso, i dati suggeriscono che il PCHS possa rappresentare un’alternativa promettente e sostenibile per il controllo delle infezioni in una prospettiva “One Health”.