Improved drug delivery strategies to enhance therapeutic outcomes in metastatic melanoma

Unresolved issues in metastatic melanoma treatment led to the recent discovery of a novel targeted therapy based on the combination of two drug kinase inhibitors (i.e., kinases MEK and AURKA), which outperformed the standard of care for pre-clinical trials. However, targeting clinics, better bioavailability and in vivo tumor accumulation are needed. For the purpose, in this work we first studied drug inhibitors using several solid-state characterization techniques, including DSC, FT-IR, and X-ray diffraction analysis, aiming at understanding their chemical interaction patterns at the molecular level. From these studies, we managed to obtain novel crystalline forms of the studied drugs, expanding the available library of their solid crystalline forms. Moreover, unpublished single crystal structures obtained by X-ray diffraction were discussed and compared with FT-IR data. These studies could give ground to future co-crystallization and salt formation attempts, aiming at enhancing the physico-chemical properties of the studied MEK and AURKA drug inhibitors. In addition, we enhanced water solubility of the studied drugs exploiting drug nano-delivery. In this regard, we developed and optimized a formulation protocol to simultaneously encapsulate drugs into stealth polymeric NPs. Obtained formulations were deeply characterized in terms of NPs size distribution, volume concentration, drug loading efficiency and surface charge. Moreover, colloidal stability over time and protein corona formation upon incubation under biological conditions were assessed. In vitro results demonstrated a good NPs cellular uptake by different patient-derived melanoma models, and improved therapeutic outcome compared with drug inhibitors administered without nano-encapsulation. Of note, in vivo experiments showed more than 50% of cell positivity at tumor site in xenograft murine models, and an increase of 30% in their mean survival compared to non-encapsulated drug administration. Finally, we developed a novel protocol for the nanoencapsulation of a fluorinated probe into lipid liquid crystalline NPs. Obtained formulation was deeply characterized in terms of size distribution both in aqueous environment and using cryogenic electron microscopy techniques. Moreover, using small-angle X-ray diffraction and micro-DSC analysis, we investigated the interactions between the fluorinated probe and lipid component. Preliminary experiments using magnetic resonance techniques were performed, making the developed lipid liquid crystalline NP a promising imaging tool for in vivo 19F-MRI.

Il trattamento del melanoma metastatico presenta ancora diverse criticità, che hanno recentemente portato allo sviluppo di una nuova terapia mirata basata sulla combinazione di due inibitori di chinasi (MEK e AURKA). Nei test preclinici, questa combinazione ha mostrato risultati migliori rispetto alle terapie attualmente disponibili. Tuttavia, per un’efficace applicazione clinica, sono necessari ulteriori miglioramenti in termini di biodisponibilità e accumulo del farmaco nel tumore. In questa tesi, abbiamo inizialmente analizzato gli inibitori mediante diverse tecniche di caratterizzazione allo stato solido (DSC, FT-IR e diffrazione a raggi X) con l’obiettivo di comprenderne le interazioni chimiche a livello molecolare. Questi studi hanno permesso di ottenere nuove forme cristalline dei farmaci esaminati, contribuendo ad ampliare la loro libreria di forme solide. Inoltre, sono state discusse nuove strutture cristalline, finora inedite, ottenute tramite diffrazione a raggi X su singolo cristallo e confrontate con i dati spettroscopici. Questo approccio potrà facilitare futuri studi di co-cristallizzazione o formazione di sali, mirati a migliorare le proprietà chimico-fisiche degli inibitori di MEK e AURKA. Per aumentare la solubilità in acqua dei farmaci, abbiamo poi sviluppato un sistema di veicolazione nanometrico. A questo scopo, è stato messo a punto un protocollo di formulazione che consente l’incapsulamento simultaneo dei due farmaci in nanoparticelle polimeriche stealth. Le formulazioni sono state approfonditamente caratterizzate per quanto riguarda dimensioni, distribuzione, concentrazione volumetrica, efficienza di incapsulamento e carica superficiale. È stata inoltre valutata la stabilità colloidale nel tempo e l’interazione con proteine in condizioni fisiologiche. I test in vitro hanno mostrato un buon assorbimento cellulare delle nanoparticelle da parte di diversi modelli di melanoma derivati da pazienti, con un’efficacia terapeutica superiore rispetto ai farmaci somministrati in forma libera. Gli esperimenti in vivo, condotti su modelli murini xenotrapiantati, hanno evidenziato una marcata localizzazione delle nanoparticelle nel tumore (oltre il 50% delle cellule positive) e un aumento della sopravvivenza media del 30% rispetto alla somministrazione tradizionale. Infine, è stato sviluppato un nuovo protocollo per l’incapsulamento di una sonda fluorurata all’interno di nanoparticelle lipidiche a cristalli liquidi. La formulazione è stata analizzata in dettaglio in ambiente acquoso e mediante microscopia elettronica criogenica. Le interazioni tra la sonda e la matrice lipidica sono state investigate utilizzando tecniche di diffrazione a raggi X a piccolo angolo (SAXS) e micro-calorimetria DSC. Sono stati inoltre condotti test preliminari con tecniche di risonanza magnetica, che indicano il potenziale utilizzo di queste nanoparticelle come agenti di contrasto per l’imaging in vivo tramite MRI al fluoro-19