Acetoin metabolism enzymes as biocatalysts for asymmetric synthesis

The following summary outlines the results presented in the thesis entitled “Acetoin Metabolism Enzymes as Biocatalysts for Asymmetric Synthesis”. In the Introduction of this thesis, in Chapter 1, the field of biocatalysis will be briefly introduced and a short summary on thiamine diphosphate (ThDP)-dependent enzymes is described. Chapter 2 will illustrate the Results obtained, object of this summary, while in Chapter 3 and Chapter 4 the reader could find the Outlook and the Experimental section, respectively. The results of this thesis are structured in three interlinked chapters. Chapter 2.1 describes several examples of the combined use of a ThDP-dependent enzyme, namely Ao:DCPIP OR and a NADH-dependent reductase (AAR) for the stereoselective synthesis of enantio-enriched bioactive compounds. Thanks to this combined used approach, the synthesis of various vic-diols has been possible. Of particular interest is 2,3-dimethylglyceric acid ethyl ester (5) due to its widespread presence in many bioactive natural products. All four stereoisomers of 5 have been obtained through chemo-enzymatic strategies, which comprise the use of biocatalyst (lipases and reductases), organocatalysts (NHC) and chemical reducing agents as well, with the objective of providing greater insight into the stereochemistry of these natural bioactive compounds. Another natural compound, for which the chemo enzymatic synthesis has been investigated is potassium (2R,3R)-2,3,4-trihydroxy-2-methylbutanoate (6). This compound has the potential to act as a natural herbicide and could be directly synthesized through the key intermediate (R)-ethyl acetolactate, produced by Ao:DCPIP OR. The third example presented in this thesis is an anti-tumour agent namely retronecine N-oxide (7), which has been coupled with stereoisomers of 5, in which the activity of one diastereoisomer with respect to the others remains to be investigated. Lastly, the synthesis of different substituted norpseudoephedrine (NPEs, 4) has been described. Thanks to the pivotal carbon-carbon bond formation promoted by Ao:DCPIP OR and, in combination with different selective amine transaminases, different NPEs has been synthesized with elevated enatiomeric excesses. Subsequently, having demonstrated the potential of combining these enzymes, more technical improvements on the biocatalytic pathway were investigated in Chapter 2.2. The production of an engineered biocatalyst overexpressing both the NADH-dependent reductase AAR, and a suitable enzyme for regeneration of the cofactor has been achieved. Furthermore, the stereoselective reduction catalysed by in vivo whole cell was studied. Lastly, three different methods of whole-cell immobilization (TEOS encapsulation and PVA or agarose inclusion) were evaluated in terms of activity, long term stability and recyclability of the resulting immobilized whole cell biocatalyst. To conclude, Chapter 2.3 describes the preliminary strategy followed to modify the active site of the ThDP-dependent enzyme Ao:DCPIP OR in order to further expand the range of products achievable from the carboligation step. After identifying of the active site in the predicted structure of the enzyme, a semi-rational mutagenesis approach was followed by changing 11 amino acids in the enzymatic pocket. New potential target substrates have been synthesised and initial activity assays have been analysed, revealing interesting data that deserve further investigation.

Il seguente riassunto illustra i risultati presentati nella tesi intitolata “Enzimi del metabolismo dell'acetoino come biocatalizzatori per la sintesi asimmetrica”. Nell'Introduzione di questa tesi (Capitolo 1), verrà brevemente introdotto il campo della biocatalisi insieme ad una breve descrizione degli enzimi tiamina difosfato (ThDP) dipendenti. Il Capitolo 2 illustrerà i Risultati ottenuti, oggetto di questo riassunto, mentre nel Capitolo 3 e nel Capitolo 4 il lettore potrà trovare rispettivamente le Prospettive Future e la Parte Sperimentale. I Risultati di questa tesi sono strutturati in tre sottocapitoli interconnessi tra loro. Il Capitolo 2.1 descrive diversi esempi di utilizzo combinato di un enzima ThDP-dipendente, chiamato Ao:DCPIP OR e di una reduttasi NADH-dipendente (AAR) per la sintesi stereoselettiva di composti bioattivi enantio-arricchiti. Grazie a questo approccio combinato, è stato possibile sintetizzare diversi dioli vicinali. Di particolare interesse è l'estere etilico dell'acido 2,3-dimetilglicerico (5) per la sua diffusa presenza in molti prodotti naturali bioattivi. Tutti e quattro gli stereoisomeri di 5 sono stati ottenuti attraverso strategie chemo-enzimatiche, che comprendono l'uso di biocatalizzatori (lipasi e reduttasi), organocatalizzatori (NHC) e agenti chimici riducenti, con l'obiettivo di fornire una maggiore comprensione della stereochimica di questi composti naturali bioattivi. Un altro composto naturale, per il quale è stata studiata la sintesi chemo-enzimatica, è il potassio (2R,3R)-2,3,4-triidrossi-2-metilbutanoato (6). Questo composto ha il potenziale per agire come erbicida naturale e potrebbe essere sintetizzato sfruttando come intermedio chiave il composto (R)-etil acetolattato, sintetizzato direttamente da Ao:DCPIP OR. Il terzo esempio presentato in questa tesi è un agente antitumorale, la retronecina N-ossido (7), che è stato accoppiato con gli stereoisomeri di 5, in cui l'attività di un diastereoisomero rispetto agli altri rimane da indagare. Infine, è stata descritta la sintesi di diversi sostituiti della norpseudoefedrina (NPEs, 4). Grazie alla formazione di legami carbonio-carbonio promossa da Ao:DCPIP OR e, in combinazione con diverse amino transaminasi stereo-selettive, sono stati sintetizzati diversi NPE con elevati eccessi enantiomerici. Successivamente, dopo aver dimostrato il potenziale nella combinazione di questi enzimi, nel Capitolo 2.2 sono stati studiati ulteriori miglioramenti tecnici dell’approccio biocatalitico. È stato così ottenuto un biocatalizzatore ingegnerizzato che sovra esprime sia la reduttasi AAR dipendente dal NADH, sia un enzima adatto alla rigenerazione del cofattore. Inoltre, è stata studiata la riduzione stereoselettiva catalizzata da cellule intere in vivo. Infine, sono stati valutati tre diversi metodi di immobilizzazione del biocatalizzatore (incapsulamento in TEOS e inclusione in PVA o agarosio) in termini di attività, stabilità a lungo termine e riciclabilità del biocatalizzatore immobilizzato. Per concludere, il Capitolo 2.3 descrive la strategia preliminare seguita per modificare il sito attivo dell'enzima ThDP-dipendente Ao:DCPIP OR al fine di ampliare ulteriormente la gamma di prodotti ottenibili dalla reazione di carboligazione. Dopo aver identificato il sito attivo dell’enzima nella previsione bioinformatica della struttura proteica, è stato seguito un approccio di mutagenesi semi-razionale modificando 11 aminoacidi nella tasca enzimatica. Sono stati sintetizzati nuovi potenziali substrati bersaglio e sono stati analizzati i primi saggi di attività, rivelando dati interessanti che meritano ulteriori indagini.