Structure and Dynamics of Lipid/Saccharide Complexes

Il mio lavoro di tesi ha riguardato la caratterizzazione della struttura e della dinamica atomica di sistemi per la somministrazione e veicolazione di farmaci non solubili in acqua. Le loro proprietà , sia strutturali che dinamiche, sono alla base del corretto funzionamento di tali vettori. Il progetto nasce da una collaborazione con il gruppo del Prof. Colombo del Dipartimento Farmaceutico dell'Università  di Parma; il lavoro svolto da questo gruppo ha infatti riguardato la progettazione dei sistemi studiati e la loro caratterizzazione per possibili applicazione farmaceutiche. Un sistema per il trasporto di un farmaco deve dimostrare capacità  di incapsulamento, solubilizzazione, rilascio ottimale, stabilità  a lungo termine e bassa tossicità . I sistemi colloidali come micelle, liposomi, vescicole, cristalli liquidi e particelle nanometriche sono state indicati, negli ultimi 15-20 anni, come sistemi molto promettenti per la veicolazione di farmaci. L'incapsulamento di molecole attive all'interno dei vettori non solo le protegge dall'attacco chimico e enzimatico a cui sarebbero altrimenti esposte ma rende possibile il controllo sia del sito di rilascio, sia della cinetica di tale processo. Tra i sistemi colloidali quelli a base liposomiale sono stati maggiormente studiati; alcuni sono attualmente impiegati e altri in fase di certificazione. Per le loro caratteristiche strutturali i liposomi possono essere usati per veicolare sia sostanze idrosolubili sia quelle lipofile. La struttura del liposoma ਠinfatti caratterizzata da un nucleo centrale acquoso in cui la prima classe di molecole puಠessere racchiusa e protetta dall'ambiente esterno (anch'esso acquoso). La regione che si interfaccia tra i due ambienti ਠtipicamente un doppio strato lipidico. Questo strato ਠcaratterizzato da una zona centrale altamente lipofila in cui molecole idrofobiche possono essere solubilizzate, e come nel caso precedente, protette dall'ambiente esterno. Tuttavia l'impiego di puri liposomi come vettori presenta alcune limitazioni; la principale ਠla scarsa stabilità  temporale del sistema e la difficoltà  di ottenere elevati livelli di bio-adesione. Per questo motivo sono stati recentemente sviluppati sistemi composti da una parte lipidica e una saccaridica. L'aggiunta della componente saccaridica induce infatti maggior stabilità  strutturale al sistema, fornisce maggior protezione contro la degradazione enzimatica e soprattutto rende le particelle altamente bio-adesive. In particolare, l'uso combinato di lipidi e zuccheri elettrostaticamente carichi (ionici) ha dato i migliori risultati. I vettori studiati in questo lavoro sono nanoparticelle lipido/saccaridiche sviluppate per la veicolazione di farmaci lipofili (non solubili in acqua). La componente lipidica adottata ਠlecitina di soia. Questa scelta ਠstata dettata dalla necessità  di sviluppare un sistema con costi contenuti per un eventuale scale-up a livello industriale. La lecitina utilizzata (Lipoid S45) ਠinfatti una miscela commerciale di diversi fosfolipidi e acidi grassi. La sua composizione ਠtale da indurre una carica netta negativa ai lipidi; si tratta quindi di una miscela anionica. La componente saccaridica ਠinvece chitosano, un polisaccaride lineare caratterizzato dalla presenza di un residuo amminico per ogni monomero. In ambiente acido (pH<5) questo residuo lega un protone dal solvente inducendo una carica positiva netta allo zucchero. Grazie a questa carica il chitosano mostra un elevato potere di adesione sulle pareti cellulari, caratteristica che facilita la cattura dei vettori da parte delle cellule. Entrambe le componenti sono largamente utilizzate in ambito medico, farmaceutico e alimentare; sono considerate infatti bio-compatibili e atossiche. Le particelle studiate in questo lavoro sono originate dall'auto aggregazione delle molecole lipidiche e dalla loro contemporanea interazione con la componente saccaridica. Le forze che guidano il processo di self-assembly sono principalmente due: l'interazione idrofobica e quella elettrostatica. Ne consegue la formazione di particelle sferiche, con dimensioni caratteristiche dell'ordine di poche centinaia di nanometri, come risulta da misure di microscopia elettronica e scattering dinamico di luce. La loro struttura interna ਠstata invece studiata tramite diffrazione a basso angolo di neutroni e raggi X. I risultati della caratterizzazione strutturale sono illustrati nel capitolo "Structural characterization:results & discussion". Ne ਠemersa una struttura caratterizzata da un nucleo centrale acquoso circondato da una ripetizione ordinata di doppi strati lipidici separati l'uno dall'altro da una regione contenente solvente e chitosano. Tali sistemi sono inoltre caratterizzati da una carica superficiale non nulla: il processo di self-assembly non si ferma una volta raggiunto, in termini di composizione, il bilancio di carica ma una maggior quantità  di polielettrolita viene adsorbito sulla superficie delle nanoparticelle. Tale comportamento, descritto come re-entrant condensation effect, ha origine entropica ed ਠlegato all'instaurazione di un ordine locale del polisaccaride sulla superficie del doppio strato lipidico. Il numero di strutture doppio strato-chitosano per nanoparticella (grado di multilamellarità ) ਠrisultato determinato dal rapporto lecitina/chitosano utilizzato in fase di preparazione. La multilamellarità  del sistema ਠrisultata direttamente correlata anche alla capacità  di questi sistemi di incapsulare una sostanza lipofila. Pi๠ਠelevato il numero di particelle multi lamellari (a partire dalla stessa quantità  di lipidi) maggiore ਠla quantità  di molecole che ਠpossibile incapsulare. Questa abilità  e il corrispondente processo spontaneo di rilascio del farmaco sono stati analizzati utilizzando due principi attivi di prova: progesterone (PG) e tamoxifene citrato (TAM). Il primo un ormone femminile che viene utilizzato come farmaco, mentre il tamoxifene ਠun principio attivo somministrato nella cura e prevenzione del tumore al seno. Entrambe le molecole sono lipofile e hanno una bassissima solubilità  in acqua (8 ?g/ml e 14 ?g/ml rispettivamente). La differenza tra le due sostanze ਠla carica elettrostatica portata: il PG ਠneutro mentre il TAM ਠpositivamente carico e puಠquindi interagire attrattivamente con la lecitina e repulsivamente con il chitosano. La loro solubilità  risulta decisamente aumentata se incapsulati nelle nanoparticelle, si ottengono infatti valori di 100 ?g/ml per il PG e 600 ?g/ml per il TAM. Se si considera che la concentrazione delle sole nanoparticelle in soluzione ਠpari allo 0.02%, corrispondente a 2.1 mg/ml, i valori di solubilità  modificata risultano notevoli. L'ulteriore aggiunta di eccipienti farmaceutici (come l'isopropil-miristato, IPM) permette, nel caso del progesterone, di incrementarne la solubilità  fino a 1500 ?g/ml. Quest'aumento ਠstato confrontato con le modifiche indotte dall'IPM nella struttura delle nanoparticelle e ha confermato la diretta correlazione tra multilamellarità  e potere di incapsulamento. Le particelle caricate con il tamoxifene hanno proprietà  strutturali diverse da quelle di particelle vuote o caricate con un farmaco neutro. Da misure di diffrazione a basso angolo di neutroni e raggi X ਠemerso che il chitosano non prende parte alla formazione delle particelle che risultano quindi composte da una ripetizione ordinata di doppi strati lipidici contenenti tamoxifene. La regione tra due doppi strati consecutivi, che prima era composta da solvente e chitosano, ਠora invece riempita di sola acqua. Questo effetto risulta indotto dalla repulsione elettrostatica tra il farmaco e lo zucchero. L'assenza del chitosano dalle particelle ਠstata confermata da misure colorimetriche; il polisaccaride rimane quindi in soluzione sotto forma di catena estesa. Le analisi di incapsulamento e quelle strutturali hanno permesso di determinare il rapporto ottimale tra chitosano e lecitina da utilizzare per ottenere particelle stabili con un'elevata capacità  di carico per diversi farmaci. Tale rapporto ਠrisultato essere di 1 a 20 (chitosano/lecitina in peso; sistema indicato come NCL20).