Dinamica e regolazione allosterica dell'enzima umano serina racemasi

La serina racemasi umana (hSR) àƒ¨ un enzima piridossal 5ࢠ-fosfato (PLP) dipendente che catalizza la racemizzazione reversibile dellࢠL-serina a D-serina e la ?-eliminazione dellࢠL/D-serina a piruvato e ammoniaca nel cervello dei mammiferi. La D-serina àƒ¨ il principale co-agonista dei recettori N-metil-D-aspartato (NMDA) e hSR potrebbe essere un target alternativo per controllare la concentrazione di questo amminoacido nel cervello. Lo scopo di questo lavoro àƒ¨ stato di studiare la dinamica di hSR con particolare attenzione per la regolazione allosterica da parte dellࢠATP. Sono stati utilizzati due approcci: lo studio delle variazioni conformazionali indotte da ligandi tramite proteolisi limitata e la caratterizzazione del ruolo di alcuni residui amminoacidici nella comunicazione allosterica tra sito attivo e sito di legame dellࢠATP. Nel primo caso àƒ¨ stato messo a punto uno studio di proteolisi limitata utilizzando tripsina. La cinetica di digestione della proteina àƒ¨ stata caratterizzata in assenza di ligandi, in presenza degli attivatori CaCl2, MgCl2, AMP-PCP (un analogo stabile dellࢠATP) e degli inibitori malonato, glicina e NADH e analoghi strutturali. I polipeptidi ottenuti sono stati separati tramite SDS-PAGE e in alcuni analizzati mediante spettrometria di massa. Lࢠaddizione di CaCl2 o MgCl2 ha stabilizzato la proteina, mentre lࢠaggiunta di AMP-PCP non ha portato cambiamenti nel pattern di proteolisi. Questo risultato àƒ¨ in accordo con il dato cristallografico di SR di lievito in complesso con AMP-PCP che dimostra lࢠassenza di variazioni conformazionali in seguito a legame con il nucleotide. Il pattern di proteolisi limitata cambia invece quando lࢠAMP-PCP àƒ¨ addizionato insieme ad un ligando del sito attivo, come il malonato. Lࢠanalisi dei frammenti di proteolisi mediante spettrometria di massa ha permesso di identificare una regione della proteina, composta da una porzione del dominio maggiore e dallࢠintero dominio minore, che viene stabilizzata in presenza dei due ligandi. Questo risultato suggerisce che àƒ¨ stata isolata una conformazione di hSR in complesso con lࢠATP e un ligando, rilevante per indagare i dettagli molecolari della regolazione allosterica dellࢠenzima. Lࢠindagine sulla comunicazione allosterica tra sito attivo e sito dellࢠATP àƒ¨ stata ulteriormente affrontata attraverso uno studio filogenetico combinato alla mutagenesi sito-specifica. Dallࢠanalisi della struttura di SR di lievito in complesso con lࢠAMP-PCP, àƒ¨ stato identificato un network di legami a idrogeno, formato da cinque amminoacidi M53, N84, Q87, E281, N311 e molecole dࢠacqua, che connette il PLP e lࢠATP. Questo collegamento potrebbe essere importante per la regolazione della struttura del sito attivo in presenza del ligando, che risulta nella stimolazione dellࢠattivitàƒÂ  di ?-eliminazione. Dal confronto di diverse sequenze di SR àƒ¨ stato osservato che si ha Q87 (89 in hSR) in quasi tutte e una A in SR di pianta, la cui attivitàƒÂ  non àƒ¨ regolata da nucleotidi. La Q àƒ¨ conservata in omologhi strutturali di SR la cui attivitàƒÂ  àƒ¨ regolata da nucleotide, quali le treonine deaminasi, ma non in serine deidratasi (SDH) che non sono controllate da nucleotidi e presentano una M. Per chiarire il ruolo di questo residuo il mutante Q89M àƒ¨ stato purificato e caratterizzato. In seguito a mutazione àƒ¨ stata osservata una quasi completa perdita della stimolazione dellࢠattivitàƒÂ  di ?-eliminazione dellࢠL-Ser da parte dellࢠATP. In Q89M-hSR il legame dellࢠATP non àƒ¨ cooperativo come osservato per la proteina wt e lࢠaffinitàƒÂ  di legame àƒ¨ simile a quella misurata sulla conformazione ad alta affinitàƒÂ  di hSR. La mutazione inoltre abolisce il cross-talk tra i siti attivo e allosterico, come dimostrato dagli effetti trascurabili del legame della glicina sullࢠaffinitàƒÂ  per lࢠATP. Nel complesso questi dati hanno dimostrato che Q89 àƒ¨ un residuo chiave nella comunicazione allosterica tra il sito attivo e il sito di legame dellࢠATP in hSR.