Novel insights on the regulation of the EAAT3/EAAC1 glutamate transporter : interactions with the actin cytoskeleton and induction by retinoic acid

Questo lavoro di tesi, ਠstato dedicato allo studio di alcuni nuovi meccanismi di regolazione del trasportatore per il glutammato EAAC1, la controparte murina del carrier EAAT3 umano. In particolare ਠstato dimostrato che in cellule C6 di glioma di ratto l'attività  del trasportatore EAAC1 dipende dall'integrità  del citoscheletro actinico. Sia la Latrunculina A che la Citocalasina D, due tossine in grado di depolimerizzare i microfilamenti actinici, causavano infatti una sensibile riduzione dell'attività  del trasportatore EAAC1 diminuendo la sua espressione di membrana. Tuttavia, anche dopo il trattamento con le due tossine, era osservabile la stimolazione del trasporto di aspartato EAAC1 causatoa dall'attivazione di PKC. In aggiunta, ਠstato dimostrato successivamente che il trafficking di EAAC1 era dipendente anche dalla componente microtubulare, dato che la Colchicina inibiva sensibilmente l'influsso di aspartato mediato dal carrier. Questa prima serie di risultati hanno dimostrato che EAAC1 interagisce sia con i microfilamenti di actina che con i microtubuli e hanno suggerito l'esistenza di diversi pools intracellulare del trasportatore. Sono stati recentemente identificati diversi partner molecolari di EAAC1 capaci di influenzarne sia l'attività  di trasporto che il traffico di membrana. Abbiamo quindi ipotizzato l'esistenza di componenti proteine legate al citoscheletro come possibili partner del trasportatore. La nostra attenzione ਠstata rivolta verso l'adducina, una actin-binding protein recentemente scoperta essere associata a diversi carriers e coinvolta nel loro traffico intracellulare. Grazie ad esperimenti di microscopia confocale, abbiamo osservato l'esistenza di specifiche aree di colocalizzazione perinucleare tra EAAC1 e adducina sia prima che dopo attivazione di PKC. Queste evidenze sono state successivamente confermate da approcci biochimici di coimmuno precipitazione, dimostrando l'effettiva esistenza di una interazione PKC-indipendente tra alcuni pools di EAAC1 e adducina. La specificità  di questo legame ਠstata dimostrata applicando i medesimi approcci sperimentali su cellule C6 esprimenti adducina marcata in emoagglutinina (HA), ottenute mediante transfezione stabile. Al fine di studiare pi๠dettagliatamente la natura di questa interazione, abbiamo tentato di identificare condizioni sperimentali che fossero capaci di modificare l'espressione del trasportatore. I risultati ottenuti hanno dimostrato che il trattamento cronico delle cellule C6 con acido all-trans retinico (ATRA) induceva un sostanziale aumento sia dell'espressione della proteina EAAC1 che del proprio gene codificante Slc1a1. In cellule sovra esprimenti il trasportatore, la quantità  di adducina coimmunoprecipitata con esso era sensibilmente aumentata rispetto alla quota osservata in cellule non trattate con ATRA. Questi risultati hanno dimostrato quindi che l'adducina ਠun effettivo partner molecolare del trasportatore EAAC1. Di particolare rilevanza biologica ਠin oltre l'effetto mediato da ATRA sull'espressione di EAAC1, visto che dati di letteratura riguardanti la sua regolazione a livello genico sono ancora scarsi. Studiando pi๠dettagliatamente questo fenomeno, abbiamo osservato che il trattamento cronico con ATRA aumentava di quattro volte l'attività  del trasporto di aminoacidi anionici in cellule C6, dovuto ad un aumento di espressione della proteina EAAC1. Mentre l'RT-qPCR dimostrava un proporzionale aumento di espressione del gene Slc1a1, l'immunofluorescenza mostrava un profondo cambiamento morfologico delle cellule C6 trattate con ATRA, suggerendo che l'induzione di Slc1a1 poteva essere uno step di un processo differenziativo. Questa ipotesi era supportata dall'induzione di Plp, un tipico marker di differenziamento oligodendrocitario, nelle medesime condizioni sperimentali nelle quali Slc1a1 era stimolato, mentre Gfap e Tubulina beta 3, due markers di differenziamento, rispettivamente astrogliale e neuronale, erano down-regolati. Abbiamo quindi documentato per la prima volta l'induzione di EAAC1 mediante l'utilizzo di un agente differenziante e come l'espressione del trasportatore possa essere considerata un marker di differenziamento oligodendrocitario. Recenti sviluppi di questo studio sono stati finalizzati a confermare gli effetti di ATRA in modelli cellulari ex vivo sia di precursori oligodendrocitari che di oligodendrociti maturi. Sono stati studiati i meccanismi molecolari sottostanti agli effetti di ATRA, dimostrando che la stimolazione dell'attività  del trasportatore EAAC1 indotta da ATRA era mediata da recettori per l'acido retinoico RAR. Infatti, mentre uno specifico agonista per i recettori RAR mimava totalmente gli effetti di ATRA, l'agonista dei recettori RXR non influenzava l'attività  del trasportatore EAAC1. Al contrario, un inibitore specifico per i RAR sopprimeva la stimolazione ATRA-dipendente di EAAC1 mentre l'inibitore selettivo per RXR non era in grado di contrastare l'effetto mediato dal retinoide. Abbiamo in oltre osservato che l'induzione mediata da ATRA di EAAC1 dipende dalla neosintesi di un intermedio proteico e non da un aumento dell'emivita del messaggero di Slc1a1. E' noto che l'ATRA induce l'espressione di RAR? in diversi modelli cellulari sia a livello di mRNA che di proteina. Anche nelle nostre condizioni sperimentali ATRA causava l'induzione di questo recettore e abbiamo quindi ipotizzato che la stimolazione di Slc1a1 richieda l'espressione ATRA-dipendente del recettore. Significativo ਠil dato derivante da esperimenti di silenziamento genico per RAR? in cui si osservava una forte inibizione dell'espressione di Slc1a1 cosଠcome quella di RAR? dopo trattamento con ATRA. Questi risultati suggeriscono che Slc1a1 sia un gene target di RAR?.