Caratterizzazione di isolati del virus della tristeza degli agrumi mediante elettroforesi capillare della conformazione dei polimorfismi del singolo filamento (CE-SSCP) e messa a punto di protocolli di analisi rapida.

Citrus tristeza virus (CTV) e' una specie virale del genere Closterovirus che causa una delle malattie piu' dannose per l'agrumicoltura. Il CTV ha portato alla morte oltre 85 milioni di piante di agrumi in tutto il mondo e reso economicamente improduttive altrettante. L'uso di portinnesti tolleranti consente di arginare gli effetti di alcuni ceppi del virus ma non di tutti. L'eradicazione delle piante infette e' una strategia di lotta efficace, perseguita in molti Paesi del mondo e valida fino al punto in cui la malattia non habbia ancora assunto livelli di diffusione superiori al 5%. Superato questo limite la ricerca e l'esperienza suggeriscono l'estirpazione limitata alle piante affette da ceppi virulenti e l'impiego di tecniche di protezione crociata o di interferenza. Per questo motivo, negli anni recenti, sono state messe a punto numerose tecniche per la caratterizzazione degli isolati di CTV. Oltre ai saggi biologici, troppo lunghi e costosi, affidabili sono l'uso di multiple-molecular-markers (MMM) (molto laborioso) ed il sequenziamento (non accessibile a tutti i laboratori). Informazioni utili puo' dare l'analisi della conformazione dei polimorfismi del filamento singolo (SSCP) della quale, nella ricerca oggetto del dottorato, si e' cercato di migliorare la potenzialita' attraverso l'elettroforesi capillare. La ricerca eseguita ha permesso di mettere a punto e validare protocolli di CE-SSCP (elettroforesi capillare dell'analisi della conformazione dei polimorfismi del filamento singolo) specifica per CTV. Questa tecnica abbina le potenzialita' della tradizionale tecnica SSCP ai vantaggi dell'elettroforesi capillare. Per la messa a punto del metodo sono stati utilizzati tre isolati provenienti dalla Sicilia (SG29, Tapi e TDV) e un isolato esotico (RPC3), precedentemente caratterizzati biologicamente. I prodotti dell'amplificazione dei geni p18 (425bp), p23 (594bp) e p25 (415bp) sono stati utilizzati per l'analisi SSCP e CE-SSCP. I profili ottenuti hanno permesso di clusterizzare gli isolati SG29, RPC3, TDV e Tapi in gruppi differenti. TDV e Tapi, isolati da piante provenienti dallo stesso vivaio e presenti in due appezzamenti contigui hanno mostrato profili simili, cosi' come tanti altri isolati provenienti da piante dell'areale. SG29 e RPC3 hanno mostrato sintomi gravi in tutte le piante indicatrici, mentre Tapi e TDV hanno mostrato sintomi tipici degli isolati blandi. Le analisi filogenetiche rivelano che questi due isolati sono localizzati in un cluster che comprende le varianti di sequenza dei ceppi blandi, mentre SG29 e RPC3 ricadono nel clado degli isolati virulenti. In base ai risultati ottenuti la tecnica e' stata utilizzata per caratterizzare 54 isolati di CTV provenienti da diversi areali della Sicilia, ai fini della validazione e della definizione del protocollo di analisi. Dalla vasta gamma di pattern ricavati e' stata effettuata una suddivisione in 9 gruppi. In alcuni di essi vi erano gruppi di piante residenti in appezzamenti agrumicoli vicini. La clusterizzazione arbitraria degli isolati e' stata confermata dai dati ottenuti dalla caratterizzazione biologica e dalle analisi filogenetiche. Per poter consentire una migliore applicazione del metodo messo a punto e' stato anche predisposto un protocollo di analisi che combina, in maniera sequenziale, la tecnica molecolare CE-SSCP con il test immunologico DAS-ELISA. In tal modo e' possibile abbinare la rapidita' dello screening all'analisi della struttura genetica, risparmiando tempo e risorse. Il metodo e' altamente sensibile, semplice e particolarmente conveniente per l'analisi rapida di numerosi campioni. In tale circostanza consente di sviluppare una rapida caratterizzazione della variabilita' genetica di popolazioni di isolati del virus, risultando vantaggioso rispetto alla SSCP convenzionale, anche per la migliore risoluzione e per la possibilita' di accumulare i dati e di gestirli tramite un software.