Modificazioni del fenotipo e dell'espressione genica in semenzali di arancio amaro inoculati con Citrus tristeza virus.

La tristeza degli agrumi, causata da Citrus tristeza virus (CTV) e' uno dei fattori limitanti l'agrumicoltura mondiale. Nonostante il considerevole impegno della ricerca, le informazioni sulla caratterizzazione degli isolati del virus sono limitate ai geni principali. Ancora in fase preliminare sono anche gli studi sull' espressione genica a parte un recente lavoro su piante di lima messicana in risposta a due differenti ceppi di CTV. Questo studio ha riguardato la risposta fenotipica di indicatrici diverse, dopo inoculazione con un isolato virulento di CTV e le connesse modificazioni dell'espressione genica in arancio amaro, lima messicana, pompelmo Duncan, cedro Etrog e alemow. L'isolato utilizzato e' stato selezionato nel corso di indagini preliminari. Dopo la caratterizzazione con test biologici su piante indicatrici le analisi molecolari hanno permesso di concludere che si tratta di un isolato con un 99% di identita' nucleotidica con alcuni ceppi del Sud America (BaraoB, Val-CB e C271-2), verosimilmente appartenente al biogruppo 4. Le relazioni che il virus stabilisce con la pianta ospite sono state studiate attraverso una ricerca mirata ad accertare le modificazioni del profilo genico sulle piante sopra indicate inoculate sperimentalmente. Allo scopo e' stato utilizzanta la tecnica del reverse northern blot con specifiche sonde, la real time e la tecnica espressione differenziale dell' RNA messaggero (DDRT-PCR). Dopo una prima fase dedicata alla ricerca bibliografica sull' uso di tecniche molecolari per lo studio della modulazione genica in piante di agrumi, con riferimento a stress biotici e abiotici, sono state valutate le differenze tra piante di arancio amaro inoculate con l'isolato di CTV selezionato (SG29) e piante sane mediante reverse Northern blot, utilizzando sonde ricavate da una ricerca sulle infezioni di Citrus exocortis viroid (CEVd) in piante di cedro Etrog. Successivamente mediante real time PCR quantitativa sono stati selezionati sette geni, risultati differenzialmente espressi in arancio amaro, al fine di valutarne la modulazione in cinque specie di agrumi (arancio amaro, lima messicana, cedro, pompelmo e alemow) inoculati con CTV SG29. E' stata infine effettuata l'analisi differenziale dell' RNA messaggero in semenzali di arancio amaro inoculati con CTV SG29. Le analisi real time PCR hanno messo in evidenza che nei semenzali di arancio amaro, il gene della metallotioneina (MT), il regolatore del sileziamento genico (rgs-CaM) e il gene COSTANS-like, risultavano sovra espressi; di contro l'espressione dell' EREBP e del gene della perossidasi (PRX) mostravano un differente comportamento risultando sotto espressi. I geni codificanti per l'alcool deidrogenasi (ADH) e la permeasi degli amminoacidi, risultavano essere rispettivamente sotto e sovra espressi, mentre i geni per l' ADH e per la PRX, coinvolti nella risposta generale ai fattori di stress, si mostravano sotto espressi in tutti gli ospiti saggiati. Viceversa, rgs-CaM, AP e CLP erano sotto espressi nel cedro Etrog, nel pompelmo e nell'arancio dolce e sovra espressi nell' arancio amaro. La sovra espressione dell' EREBP, era presente solamente nel cedro Etrog e nell' arancio dolce, mentre MT era indotto solo nell'arancio amaro e nell' arancio dolce. Nella lima messicana, cosi come nei semenzali di arancio amaro, l' infezione di CTV ha indotto la sotto espressione di tutti i geni selezionati eccetto il gene rgs-CaM che risultava drasticamente sovra espresso. Dal momento che entrambi gli ospiti sono suscettibili a CTV SG29 e reagiscono con sintomi molto gravi, si ipotizza che l'azione dell' rgs-CaM come soppressore del silenziamento genico sia specie-specifico e che CTV induca fortemente la sua espressione nelle piante suscettibili, riuscendo ad evadere l'attivita' di silenziamento dell' RNA. L'analisi differenziale (DDRT-PCR) ha permesso di individuare l' alterazione di altri 4 geni (up e down) a seguito dell'inoculazione con CTV. Due di essi mostrano una elevata omologia di sequenza con 2 diverse sequenze EST di Citrus sinensis la cui funzione risulta pero' sconosciuta, la terza e' altamente omologa ad un retrotrasposone di Arabidopsis thaliana, il cui ruolo in condizioni di stress biotici e abiotici e' largamente riportato in letteratura. L' ultimo trascritto, che risulta invece essere regolato negativamente, codifica per una proteina del citocromo P450.