Caratterizzazione molecolare e funzionale della Polinucleotide fosforilasi dall'eubatterio antartico Pseudoalteromonas Haloplanktis

L'enzima polinucleotide fosforilasi (PNPasi, E.C. 2.7.7.8) ਠcoinvolto nel metabolismo dei nucleotidi, sia negli eucarioti che nei procarioti. L'enzima catalizza la degradazione fosforolitica dell'RNA, rilasciando nucleosidi 5'-difosfato dall'estremità  3' del substrato, e la reazione inversa di polimerizzazione. In questo lavoro ਠdescritta la purificazione e la caratterizzazione biochimica della PNPasi isolata dall'eubatterio psicrofilo di origine Antartica Pseudoalteromonas haloplanktis (Ph, temperatura ottimale di crescita 4-20°C) identificata sulla base della sua capacità  di catalizzare la seguente reazione reversibile: RNA(n) + Pi ? RNA(n-1) + ppN L'enzima ha mostrato una struttura omotrimerica con un Mr pari a 255000, come valutato da analisi della massa molecolare in condizioni native e denaturanti. Utilizzando software bioinformatici dedicati sono state ottenute, a partire dalla sequenza amminoacidica, predizioni della struttura secondaria e terziaria del monomero. Inoltre, sono stati condotti studi sulla composizione amminoacidica che hanno permesso di evidenziare che la PhPNPasi mostra i tipici adattamenti delle proteine psicrofile. I parametri cinetici sono stati determinati a 15°C, utilizzando poli(A) come primer e GDP marcato come substrato. E' stato valutato l'effetto sull'attività  enzimatica di concentrazioni crescenti di GDP, consentendo di calcolare i parametri cinetici. L'attività  della PhPNPasi ਠrisultata essere stimolata dalla presenza di alcuni cationi monovalenti nella miscela di reazione, caratteristica già  evidenziata per un altri enzimi isolati da P. haloplanktis. Tra essi il CsCl ad una concentrazione 0,9 M ਠrisultato il pi๠efficace, aumentando l'attività  dell'enzima di circa 7 volte. L'attività  enzimatica della PhPNPasi aumenta con l'incremento della temperatura, raggiungendo un valore massimo a 40°C; oltre questa temperatura si osserva un decremento della velocità  di reazione, probabilmente dovuto alla sua inattivazione termica. Nell'intervallo 0-40°C ਠstato calcolato un valore di energia di attivazione (Ea) pari a 87 kJ/mol. La PhPNPasi ਠun enzima piuttosto sensibile al trattamento termico, infatti l'energia di attivazione della reazione di inattivazione termica nell'intervallo 30-70°C ਠrisultata pari a 96,7 kJ/mol, valore significativamente pi๠basso di quello osservato per altre proteine isolate da fonti mesofile o termofile. La termostabilità  di questo enzima ਠstata valutata anche con analisi di tipo spettroscopico. Le curve di UV melting hanno mostrato una temperatura di semidenaturazione di 46°C, valore significativamente pi๠alto di quello a cui si registra la massima attività  catalitica. I risultati indicano che il centro catalico della PhPNPasi ਠmolto meno stabile del resto della struttura della proteina.