Analisi dell'attività antimicrobica e antivirale dei prodotti di geni codificanti gli anticorpi

Il progetto si ਠproposto di selezionare peptidi e/o proteine codificati da geni coinvolti nella sintesi degli anticorpi (Ab) che possiedano attività  biologiche d'interesse, quali attività  antimicrobica ed antivirale, e di indagare il loro possibile meccanismo d'azione. In particolare alcuni peptidi oggetto di studio di lavori precedenti, derivati da differenti frammenti corrispondenti ai CDR (complemetarity determining regions) degli Ab e molti decapeptidi, rappresentanti la regione variabile di un Ab anti-idiotipico ricombinante immagine interna di una tossina killer di lievito, avevano mostrato una significativa attività  fungicida in vitro e in vivo nei confronti di Candida albicans (Polonelli L. et al. Infect. Immun. 2003; Polonelli L. et al. PLoS ONE 2008). Il frammento pi๠attivo sia in vivo che in vitro, chiamato P6, ਠstato mutagenizzato sostituendo il primo residuo amminoacidico con una alanina, ottenendo un peptide killer (KP), caratterizzato da una incrementata attività  in vitro e terapeutica in vivo nei confronti di candidosi vaginale e sistemica, criptococcosi e paracoccidomicosi (Polonelli L. et al. Infect. Immun. 2003; Cenci E. et al. Cell. Microbiol. 2004; Travassos L.R. et al. J. Antimicrob. Chemoter. 2004). KP ha, inoltre, mostrato attività  antivirale sia nei confronti del virus influenzale A che di HIV (Casoli C. et al. AIDS 2006; Conti G. et al. Antimicrob. Agents Chemother. 2008). Successivamente, peptidi Fc, derivati da frammenti comuni a diversi tipi di Ab, ipoteticamente prodotti per azione di proteasi fisiologiche, si sono mostrati fungicidi in vitro nei confronti di diversi lieviti patogeni, inclusi ceppi resistenti a caspofungina e triazoli, ed hanno mostrato attività  terapeutica in modelli murini di candidosi vaginale e sistemica (Polonelli L. et al. PLoS ONE 2012). L'evidenza che l'attività  biologica di tali peptidi sembra essere totalmente indipendente dalla regione anticorpale da cui derivano, ha permesso di ipotizzare che gli Ab possano costituire un serbatoio inesauribile di peptidi ad elevata attività  antimicrobica, suggerendo lo sviluppo di nuovi studi basati su un approccio del tipo †œdal genoma alla proteina†�. Sulla base dei risultati ottenuti precedentemente e delle esperienze tecnico-informatiche acquisite, in questo progetto di Dottorato ci si ਠproposti di selezionare nuovi peptidi e/o proteine di derivazione anticorpale con attività  biologica, sulla base delle sequenze proteiche codificate da geni appartenenti alla famiglia delle immunoglobuline (in particolare, geni V, D e C per la catena leggera e V, D, J e C per la catena pesante) presenti nelle banche dati disponibili. Alcuni dei peptidi selezionati hanno mostrato un'interessante attività  antimicrobica nei confronti di diversi ceppi fungini e batterici, anche caratterizzati da diverse resistenze ai farmaci convenzionali, in vivo nei confronti di candidosi sperimentale in larve di Galleria mellonella, la comune camola del miele, e di esplicare attività  antitumorale in vitro ed in vivo nei confronti di cellule di melanoma. Esperimenti preliminari condotti nei confronti di HIV-1 hanno mostrato una scarsa attività  dei peptidi, nelle condizioni sperimentali adottate. I peptidi non sono risultati in alcun modo tossici nei confronti delle cellule trattate, come dimostrato mediante saggi di vitalità , emolisi e genotossicità , e saggi di citofluorimetria hanno escluso la possibilità  che possano indurre apoptosi. Inoltre, studi di microscopia confocale hanno permesso di rilevare che i peptidi penetrano molto rapidamente nelle cellule fungine (dato confermato anche da saggi di time-killing) localizzandosi preferenzialmente in una particolare zona prima di diffondere omogeneamente. Studi di microscopia a scansione hanno permesso di rilevare cellule completamente distrutte già  dopo un'ora di trattamento, mentre studi di microscopia a trasmissione hanno evidenziato la presenza nelle cellule di lievito di strutture definibili come microbodies o perossisomi, precedentemente descritte in tali cellule anche in seguito a stress ossidativo. Tale osservazione sembra confermata anche da esperimenti che hanno evidenziato la capacità  dei peptidi di indurre la formazione di specie reattive dell'ossigeno. Studi di dicroismo circolare hanno mostrato che i peptidi in soluzione assumono una conformazione random coil stabile, mentre l'aggiunta di sodio dodecil solfato (un mimotopo dei fosfolipidi di membrana) determina una riorganizzazione in una struttura simile ad una ?-elica. In presenza di lipopolisaccaride o laminarina i peptidi subiscono cambiamenti strutturali indicativi di una possibile interazione con la membrana esterna dei batteri Gram negativi o con la parete fungina. E' stato possibile identificare peptidi e/o proteine o loro derivati ingegnerizzati, che potrebbero essere sfruttati per lo sviluppo di nuovi farmaci per terapie innovative e pi๠efficaci. La comprovata attività  antimicrobica di alcuni peptidi, quali prodotti di geni codificanti gli Ab, consentirebbe ulteriori speculazioni, pi๠concettuali ma molto intriganti, a supporto di una ipotesi evoluzionistica secondo la quale gli Ab potrebbero essere il risultato dell'associazione e della combinazione di peptidi e proteine che in origine possedevano una funzione biologica aspecifica. L'associazione di molecole ad attività  aspecifica, nel corso dell'evoluzione, potrebbe aver dato origine a molecole ad attività  altamente specifica, quali gli Ab, consentendo di ipotizzare una ulteriore forte correlazione tra immunità  innata ed adattativa.