La caseina del latte ਠsuddivisa in 4 frazioni principali - ?S1-Cn, ?S2-Cn, ?-Cn e k-Cn - che rappresentano circa l'80% della proteina totale nel latte vaccino. I geni codificanti le 4 frazioni caseiniche sono organizzati in un cluster di 250bp sul cromosoma 6 del genoma bovino. Le caseine hanno diverse varianti genetiche legate a mutazioni a livello di DNA che, nella maggior parte dei casi, causano delle sostituzioni amminoacidiche nella proteina matura. La frequenza, delle diverse varianti genetiche delle caseine, cambia notevolmente nella popolazione bovina. Alcune di queste varianti, sono in grado di influenzare positivamente o negativamente caratteristiche quantitative e/o qualitative del latte vaccino. Le caseine possono essere fonti di biopeptidi, ossia brevi frammenti amminoacidici con una potenziale azione biologica nei processi metabolici. I biopeptidi si formano durante il processo digestivo della proteina matura come conseguenza dell'azione proteolitica degli enzimi digestivi. Questa tesi si concentra sulla ?-Cn e su due delle sue tredici varianti genetiche, vale a dire la variante A1 e quella A2. Le due varianti si differenziano l'una dall'altra per la sostituzione di una Pro (variante ?-Cn A2) da una His (variante ?-Cn A1) in posizione 67 della proteina matura. L'istidina in posizione 67 nella variante A1 rende il legame peptidico tra Ile66-His67 pi๠sensibile all'azione proteolitica degli enzimi digestivi rispetto a quello tra Ile66- Pro67 della variante A2. Ciಠpromuove il rilascio di un particolare biopeptide, la beta casomorphin-7 (BCM7, Tyr60-Pro61-Phe62-Pro63-Gly64-Pro65-Ile66), dalla variante A1. BCM7 ਠun biopeptide con azione morfino-simile, agonista esogeno dei recettori ?, presenti a livello del sistema nervoso centrale e periferico, del sistema immunitario e anche a livello intestinale. Alla luce di questa caratteristica, diversi studi hanno ipotizzato il suo coinvolgimento nello sviluppo di patologie umane. Tuttavia, il report dell'EFSA del 2009 †œReview of the potential health impact of beta-casomorphins and related peptides†� ha confermato l'azione negativa della variante ?-Cn A1 e della BCM7, solo sulla motilità intestinale e sulle secrezioni gastriche e pancreatiche. L'introduzione di questa tesi di dottorato ਠun esame approfondito degli studi condotti sull'effetto di ?-Cn A1 sulla salute umana, dal 2009 (dopo il Report EFSA) fino ad oggi. Nonostante gli effetti della ?-Cn A1 sulla salute umana non siano stati ancora ben chiariti, sin dal 2000 ਠpossibile trovare nei supermercati prodotti ottenuti da latte di vacche omozigoti A2A2 per il locus della ?-Cn, produttrici, quindi, di latte contenente solo la variante ?-Cn A2. In seguito al successo commerciale di questo tipo di prodotto, anche in Italia molte aziende del settore hanno iniziato a commercializzare (o ne stanno valutando la possibilità ) latte di vacche omozigoti ?-Cn A2A2. Dal punto di vista scientifico, ਠimportante stimare l'impatto della selezione degli animali omozigoti A2A2 al locus della ?-Cn (CSN2) sugli altri caratteri qualitativi e quantitativi del latte. A tal riguardo, la parte sperimentale di questa tesi di dottorato si focalizza sulla valutazione dell'associazione (LD, Linkage Disequilibrium), a livello di DNA, attraverso uno studio di GWAS (Genome Wide Association Study), dell'allele CSN2 * A2 con: (i) l'allele B della k-Cn (CSN3*B) †" visto gli effetti positivi di questo allele sulle caratteristiche del latte vaccino destinato alla caseificazione - in tori delle razze Bruna, Frisona e Simmental. (ii) SNPs (Singole Nucleotide Polimorphysms) posizionati 10Mb a monte e 10Mb a valle dalla mutazione caratterizzante l'allele CSN2*A2, in tori interamente sequenziati (WGS-Whole Genome Sequencing) appartenenti alle razze, Bruna, Frisona e Simmental. (iii) Identificazione degli SNPs posti a 10Mb a monte e 10Mb a valle della mutazione che caratterizza CSN2 * A2 con effetto significativo su alcuni caratteri oggetto di selezione in tori WGS, quindi cin genoma interamente sequenziato, di razza Frisona. I caratteri considerati sono stati la produzione di latte (MY), la produzione di proteina (PY), la produzione di grasso (FY), la percentuale di proteina (PP), la percentuale di grasso (FP) e il valore delle cellule somatiche (SCS). Di seguito sono riportati, in breve, i risultati ottenuti nelle diverse fasi di analisi: (i) Uno studio preliminare ਠstato condotto per verificare l'equilibrio di Hardy-Weinberg tra i due alleli (CSN2*A2 e CSN3*B) in 105, 450 e 274 tori, rispettivamente, delle razze Bruna, Frisona e Simmental. I risultati hanno confermato un'associazione preferenziale significativa tra CSN2*A2 e CSN3*B nei tori di razza Bruna. Tuttavia, il basso numero di tori di razza Bruna analizzati (solo 105) non consentiva di confermare l'ipotesi di genetic draft. Per questo motivo, lo studio ਠstato esteso a quasi 600 tori di razza Bruna genotipizzati per i loci CSN2 e CSN3. Questa successiva analisi ha confermato l'ipotesi di associazione preferenziale e l'effetto genetic draft tra CSN3*B e CSN2*A2 nella razza Bruna. (ii) I dati di tori WGS, sono stati esaminati per identificare altre possibili varianti di marcatori SNPs associati con CSN2*A2. In Simmental, gli SNPs localizzati a maggiore distanza, con un elevato LD (r2?0.5), sono stati rivelati a 110Kb dalla mutazione caratterizzante CSN2*A2. Nei tori di razza Frisona ਠstato osservato un risultato analogo, anche se a 3Mb a valle della mutazione sono stati individuati diversi SNPs in elevato LD con CSN2*A2, ma nessuno di questi era presente all'interno di un gene. In Simmental il blocco di LD ਠrisultato essere pi๠corto, questo potrebbe essere dovuto allo schema di selezione usato per questa razza, diverso rispetto a quello in uso per la razza Frisona focalizzato sulla produzione di latte. Nei tori di razza Bruna, invece, ਠstata identificata una regione di LD molto estesa situata a valle dalla mutazione causativa. Tuttavia, il numero limitato di animali utilizzati nelle analisi ha probabilmente distorto il segnale, aumentando il livello di LD e non mostrando un quadro affidabile della situazione. In ogni caso, in questa razza ਠevidente l'impatto della recente selezione nella regione con LD pi๠elevato. Per ogni razza esaminata, i markers SNPs trovati a monte e a valle della regione della mutazione causativa, con r2 maggiore di 0,5, sono stati identificati tramite analisi VEP (Variant Effect Predictor). Questi SNPs non sembrano avere forti conseguenze sugli open reading frames codificanti per le proteine (cioਠnon sono codoni di stop, varianti missense, etc.) (iii) Come risultato finale in seguito ad un analisi di GWAS, un tag-SNP per la mutazione causativa del polimorfismo A1 / A2, ਠstato rilevato nelle varianti presenti nel dataset BovineHD. Solo queste varianti sono state estratte dai dati WGS ed ਠstata eseguita l'analisi di LD. Il tag-SNP selezionato, cioਠSNOV BovineHD4100005296 (posizione 87.180.731), mostra un livello di LD (r2) con la mutazione causativa di 1, 1, 0,97, rispettivamente, in Bruna, Frisona e Simmental. Solo per SNPs in grado di influenzare i caratteri PP e SCS sono state osservate associazioni con il tag di CSN2*A2 oltre la soglia di significatività di Bonferroni stabilita. I risultati ottenuti in questo studio mostrano un'associazione significativa in Bruna tra gli alleli CSN2*A2 e CSN3*B ,confermando i risultati precedenti. Nella razza Bruna, grazie all'effetto hitchhiking, la variante A2 di ?-Cn sarebbe selezionata indirettamente selezionando per la variante B della k-Cn. Nella razza Frisona, al contrario, non ਠstato osservato un alto LD tra i due alleli considerati, come osservato, peraltro, anche nella razza Simmental. Inoltre, nella regione (± 10Mb) non ਠstata riscontrata la presenza di nessun'associazione (quindi nessun LD sufficientemente alto) tra CSN2*A2 e SNPs con effetto sui caratteri della produzione di latte.
Bovine ?-Casein: source of Betacasomorphin-7 with effect on human health. Genomic Imputation between A2 ?-Casein variant and other phenotypic traits
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2018
Abstract
La caseina del latte ਠsuddivisa in 4 frazioni principali - ?S1-Cn, ?S2-Cn, ?-Cn e k-Cn - che rappresentano circa l'80% della proteina totale nel latte vaccino. I geni codificanti le 4 frazioni caseiniche sono organizzati in un cluster di 250bp sul cromosoma 6 del genoma bovino. Le caseine hanno diverse varianti genetiche legate a mutazioni a livello di DNA che, nella maggior parte dei casi, causano delle sostituzioni amminoacidiche nella proteina matura. La frequenza, delle diverse varianti genetiche delle caseine, cambia notevolmente nella popolazione bovina. Alcune di queste varianti, sono in grado di influenzare positivamente o negativamente caratteristiche quantitative e/o qualitative del latte vaccino. Le caseine possono essere fonti di biopeptidi, ossia brevi frammenti amminoacidici con una potenziale azione biologica nei processi metabolici. I biopeptidi si formano durante il processo digestivo della proteina matura come conseguenza dell'azione proteolitica degli enzimi digestivi. Questa tesi si concentra sulla ?-Cn e su due delle sue tredici varianti genetiche, vale a dire la variante A1 e quella A2. Le due varianti si differenziano l'una dall'altra per la sostituzione di una Pro (variante ?-Cn A2) da una His (variante ?-Cn A1) in posizione 67 della proteina matura. L'istidina in posizione 67 nella variante A1 rende il legame peptidico tra Ile66-His67 pi๠sensibile all'azione proteolitica degli enzimi digestivi rispetto a quello tra Ile66- Pro67 della variante A2. Ciಠpromuove il rilascio di un particolare biopeptide, la beta casomorphin-7 (BCM7, Tyr60-Pro61-Phe62-Pro63-Gly64-Pro65-Ile66), dalla variante A1. BCM7 ਠun biopeptide con azione morfino-simile, agonista esogeno dei recettori ?, presenti a livello del sistema nervoso centrale e periferico, del sistema immunitario e anche a livello intestinale. Alla luce di questa caratteristica, diversi studi hanno ipotizzato il suo coinvolgimento nello sviluppo di patologie umane. Tuttavia, il report dell'EFSA del 2009 †œReview of the potential health impact of beta-casomorphins and related peptides†� ha confermato l'azione negativa della variante ?-Cn A1 e della BCM7, solo sulla motilità intestinale e sulle secrezioni gastriche e pancreatiche. L'introduzione di questa tesi di dottorato ਠun esame approfondito degli studi condotti sull'effetto di ?-Cn A1 sulla salute umana, dal 2009 (dopo il Report EFSA) fino ad oggi. Nonostante gli effetti della ?-Cn A1 sulla salute umana non siano stati ancora ben chiariti, sin dal 2000 ਠpossibile trovare nei supermercati prodotti ottenuti da latte di vacche omozigoti A2A2 per il locus della ?-Cn, produttrici, quindi, di latte contenente solo la variante ?-Cn A2. In seguito al successo commerciale di questo tipo di prodotto, anche in Italia molte aziende del settore hanno iniziato a commercializzare (o ne stanno valutando la possibilità ) latte di vacche omozigoti ?-Cn A2A2. Dal punto di vista scientifico, ਠimportante stimare l'impatto della selezione degli animali omozigoti A2A2 al locus della ?-Cn (CSN2) sugli altri caratteri qualitativi e quantitativi del latte. A tal riguardo, la parte sperimentale di questa tesi di dottorato si focalizza sulla valutazione dell'associazione (LD, Linkage Disequilibrium), a livello di DNA, attraverso uno studio di GWAS (Genome Wide Association Study), dell'allele CSN2 * A2 con: (i) l'allele B della k-Cn (CSN3*B) †" visto gli effetti positivi di questo allele sulle caratteristiche del latte vaccino destinato alla caseificazione - in tori delle razze Bruna, Frisona e Simmental. (ii) SNPs (Singole Nucleotide Polimorphysms) posizionati 10Mb a monte e 10Mb a valle dalla mutazione caratterizzante l'allele CSN2*A2, in tori interamente sequenziati (WGS-Whole Genome Sequencing) appartenenti alle razze, Bruna, Frisona e Simmental. (iii) Identificazione degli SNPs posti a 10Mb a monte e 10Mb a valle della mutazione che caratterizza CSN2 * A2 con effetto significativo su alcuni caratteri oggetto di selezione in tori WGS, quindi cin genoma interamente sequenziato, di razza Frisona. I caratteri considerati sono stati la produzione di latte (MY), la produzione di proteina (PY), la produzione di grasso (FY), la percentuale di proteina (PP), la percentuale di grasso (FP) e il valore delle cellule somatiche (SCS). Di seguito sono riportati, in breve, i risultati ottenuti nelle diverse fasi di analisi: (i) Uno studio preliminare ਠstato condotto per verificare l'equilibrio di Hardy-Weinberg tra i due alleli (CSN2*A2 e CSN3*B) in 105, 450 e 274 tori, rispettivamente, delle razze Bruna, Frisona e Simmental. I risultati hanno confermato un'associazione preferenziale significativa tra CSN2*A2 e CSN3*B nei tori di razza Bruna. Tuttavia, il basso numero di tori di razza Bruna analizzati (solo 105) non consentiva di confermare l'ipotesi di genetic draft. Per questo motivo, lo studio ਠstato esteso a quasi 600 tori di razza Bruna genotipizzati per i loci CSN2 e CSN3. Questa successiva analisi ha confermato l'ipotesi di associazione preferenziale e l'effetto genetic draft tra CSN3*B e CSN2*A2 nella razza Bruna. (ii) I dati di tori WGS, sono stati esaminati per identificare altre possibili varianti di marcatori SNPs associati con CSN2*A2. In Simmental, gli SNPs localizzati a maggiore distanza, con un elevato LD (r2?0.5), sono stati rivelati a 110Kb dalla mutazione caratterizzante CSN2*A2. Nei tori di razza Frisona ਠstato osservato un risultato analogo, anche se a 3Mb a valle della mutazione sono stati individuati diversi SNPs in elevato LD con CSN2*A2, ma nessuno di questi era presente all'interno di un gene. In Simmental il blocco di LD ਠrisultato essere pi๠corto, questo potrebbe essere dovuto allo schema di selezione usato per questa razza, diverso rispetto a quello in uso per la razza Frisona focalizzato sulla produzione di latte. Nei tori di razza Bruna, invece, ਠstata identificata una regione di LD molto estesa situata a valle dalla mutazione causativa. Tuttavia, il numero limitato di animali utilizzati nelle analisi ha probabilmente distorto il segnale, aumentando il livello di LD e non mostrando un quadro affidabile della situazione. In ogni caso, in questa razza ਠevidente l'impatto della recente selezione nella regione con LD pi๠elevato. Per ogni razza esaminata, i markers SNPs trovati a monte e a valle della regione della mutazione causativa, con r2 maggiore di 0,5, sono stati identificati tramite analisi VEP (Variant Effect Predictor). Questi SNPs non sembrano avere forti conseguenze sugli open reading frames codificanti per le proteine (cioਠnon sono codoni di stop, varianti missense, etc.) (iii) Come risultato finale in seguito ad un analisi di GWAS, un tag-SNP per la mutazione causativa del polimorfismo A1 / A2, ਠstato rilevato nelle varianti presenti nel dataset BovineHD. Solo queste varianti sono state estratte dai dati WGS ed ਠstata eseguita l'analisi di LD. Il tag-SNP selezionato, cioਠSNOV BovineHD4100005296 (posizione 87.180.731), mostra un livello di LD (r2) con la mutazione causativa di 1, 1, 0,97, rispettivamente, in Bruna, Frisona e Simmental. Solo per SNPs in grado di influenzare i caratteri PP e SCS sono state osservate associazioni con il tag di CSN2*A2 oltre la soglia di significatività di Bonferroni stabilita. I risultati ottenuti in questo studio mostrano un'associazione significativa in Bruna tra gli alleli CSN2*A2 e CSN3*B ,confermando i risultati precedenti. Nella razza Bruna, grazie all'effetto hitchhiking, la variante A2 di ?-Cn sarebbe selezionata indirettamente selezionando per la variante B della k-Cn. Nella razza Frisona, al contrario, non ਠstato osservato un alto LD tra i due alleli considerati, come osservato, peraltro, anche nella razza Simmental. Inoltre, nella regione (± 10Mb) non ਠstata riscontrata la presenza di nessun'associazione (quindi nessun LD sufficientemente alto) tra CSN2*A2 e SNPs con effetto sui caratteri della produzione di latte.I documenti in UNITESI sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
https://hdl.handle.net/20.500.14242/271314
URN:NBN:IT:UNIPR-271314