Analisi del profilo di espressione dei microRNA in cellule alfa e beta pancreatiche di topo dopo trattamento con citochine

Premessa I microRNA occupano una posizione gerarchicamente critica nella regolazione delle networks cellulari e sono quindi candidati di rilievo per un coinvolgimento patogenetico in patologie sistemiche, quali le neoplasie e le malattie degenerative. Di conseguenza, queste molecole sono concordemente ritenute i biomarcatori di nuova generazione piu' promettenti per la diagnosi, per la prognosi ed il disegno di interventi terapeutici innovativi: e' facile ipotizzare che la disponibilita ' di batterie di microRNA, ben caratterizzati dal punto di vista molecolare, strettamente associati alla patologia di interesse, e presenti nel siero, dovrebbe modificare in modo radicale le modalita' operative e le prospettive di successo nell' ambito della Medicina clinica. Obiettivo del nostro lavoro e' stato quello di contribuire alla caratterizzazione del ruolo dei microRNA nella patogenesi del Diabete Mellito (DM), ed identificare e caratterizzare un set di microRNA da utilizzare quali biomarcatori molecolari e potenziali bersagli terapeutici di tale patologia, la cui incidenza e' aumentata a livello mondiale a tal punto da giustificare l ' utilizzo del termine epidemia. Nonostante una estesa bibliografia, e' evidente che le basi molecolari del DM non sono state sufficientemente studiate a livello di sistema. Materiali e Metodi Abbiamo sfruttato un sistema modello che mima gli eventi infiammatori occorrenti in vivo in pazienti diabetici. In particolare abbiamo analizzato il trascrittoma di 518 microRNA in cellule alfa e beta pancreatiche murine (alfaTC1 e betaTC1), mediante analisi High Throughput (HT) effettuata con TaqMan Low Density Arrays per la PCR Real-Time. Le cellule sono state analizzate sia a steady state che dopo induzione di apoptosi con un cocktail di citochine (IFN-gamma, IL-1beta, TNF-alfa) per diversi tempi di esposizione (24h e 48h). Sono stati considerati differenzialmente espressi (DE) i microRNA che presentavano variazioni nell ' espressione (Fold change) di almeno 3 volte (verso l ' alto o verso il basso) nei trattati rispetto ai relativi controlli (FC maggiore o uguale a 3 o minore o uguale a 0.33) e comuni a tre controlli endogeni (snoRNA135, snoRNA202 e MammalU6). I microRNA differenzialmente espressi ottenuti sono stati ulteriormente filtrati effettuando un Paired T-Test. Una successiva analisi in silico ci ha permesso di individuare i targets predetti e validati dei miRNA DE. Risultati e Discussione Le nostre analisi hanno permesso di verificare che l ' esposizione prolungata e ad alte concentrazioni delle linee cellulari murine di glucagonoma (alfaTC1) e di insulinoma (betaTC1) al cocktail di citochine pro-infiammatorie induce marcati cambiamenti nell ' espressione dei microRNA rispetto a quanto avviene nelle stesse cellule in condizioni non perturbate ed in misura maggiore nelle betaTC1 piuttosto che nelle alfaTC1. Abbiamo identificato, nel complesso, il 6,18% (32/518) di microRNA con espressione significativamente alterata in entrambe le linee cellulari (tra questi il miR-146a, il miR-21 e il miR-34a risultano essere gia' noti in letteratura come coinvolti nel processo di secrezione insulinica nelle beta cellule e nella loro proliferazione e apoptosi). Nelle alfaTC1 sono risultati differenzialmente espressi 12 miRNA, di cui 4 risultano essere specifici del time point a 24h, 6 del time point a 48h, e 2 presentano una disregolazione costante durante l ' intero time course. Nelle betaTC1 mostrano espressione differenziale 25 miRNA, di cui 2 risultano essere specifici del time point a 24h, 13 del time point a 48h, e 10 mostrano una espressione alterata sia a 24h che a 48h. La costante disregolazione nei due time point suggerisce che tali miRNA possano avere un importante ruolo nella cascata di segnali scatenata dalle citochine. Considerando l ' intero time course si nota che 7 miRNA sono alterati in maniera specifica nelle alfaTC1, 20 nelle betaTC1 e 5 (miR-125b-5p, miR-146a, miR-155, miR-203 e miR-21) sono sovraespressi in entrambi i fenotipi cellulari. L ' induzione di miRNA sia nelle alfaTC1 che nelle betaTC1 potrebbe rappresentare un meccanismo fisiologico di risposta all ' azione delle citochine comune fra due fenotipi cellulari che condividono la stessa origine endodermica. La nostra attenzione si e' rivolta in modo particolare ai miRNA che presentano una importante alterazione dell ' espressione in una linea rispetto all ' altra, considerando anche il confronto tra i due fenotipi cellulari a steady state; maggiore importanza e' stata data ai microRNA che mostrano variazione di espressione di segno opposto nelle due linee cellulari dopo trattamento, e livelli di espressione opposti nella stessa linea cellulare prima e dopo l ' esposizione a citochine. Da questo punto di vista miR-216a, miR-216b e miR-217 rappresentano microRNA particolarmente interessanti sui quali svolgere esperimenti di genomica funzionale ai fini di verificare un possibile coinvolgimento nel Diabete Mellito (in letteratura non e' attualmente riportata alcuna correlazione tra questi miRNA e la malattia). Inoltre alcuni tra i targets predetti e validati dei DE miRNA ottenuti mediante analisi in silico sono risultati appartenere al set di geni di seconda classe candidati per il Diabete ottenuto in un lavoro recentemente completato dal nostro gruppo di ricerca [Barbagallo et al., in preparazione]: tra questi Stat3 (bersaglio dei miR-125b-5p e miR-21) e Bbc3, target del miR-148a. Conclusioni I nostri dati hanno descritto per la prima volta l ' assetto molecolare dei microRNA nelle alfa cellule pancreatiche dopo loro esposizione ad un cocktail di citochine pro-infiammatorie, oltre che gettare le basi per una migliore comprensione dei meccanismi molecolari responsabili della morte delle beta cellule. Prospettive future di questo lavoro sono: l ' identificazione delle alterazioni di pathways e networks coinvolte dopo trattamento delle cellule in vitro; la validazione dei piu' credibili tra i microRNA candidati mediante trasfezione di anti- o di pre-miRNA per determinarne il silenziamento o l ' attivazione funzionale. Mediante l ' integrazione dei dati ottenuti verra' prodotta una lista completa di microRNA, dei loro potenziali bersagli proteici e delle pathways coinvolte nell ' alterazione del fenotipo cellulare e molecolare delle cellule alfa e beta pancreatiche, in un sistema in vitro che riproduce in modo credibile le condizioni che si verificano in vivo nei pazienti durante l ' insorgenza del Diabete Mellito.