Colture cellulari di Artemisia annua L. per lo studio della via biosintetica e la produzione dell'antimalarico artemisinina

La malaria àƒ¨ una malattia febbrile acuta diffusa dalla puntura della zanzara femmina del genere Anopheles. Per piàƒ¹ di 350 anni questa malattia àƒ¨ stata trattata con chinino, ma nellࢠultimo decennio àƒ¨ stato scoperto che il chinino, non ha piàƒ¹ effetto su molti ceppi resistenti di P. falciparum. Oggi un trattamento alternativo, efficace e sicuro, contro la malaria àƒ¨ rappresentato dallࢠartemisinina, un sesquiterpene lattone estratto da una pianta medicinale cinese Artemisia annua L. LࢠArtemisia annua L. àƒ¨ una pianta aromatica erbacea annuale appartenente alla famiglia delle Asteracae. Lࢠartemisinina àƒ¨ sequestrata nei tricomi ghiandolari che ricoprono in particolar modo la superficie di foglie e fiori. La concentrazione di artemisinina nella pianta àƒ¨ relativamente bassa da 0,1 a 1% del peso secco. La produzione di artemisinina àƒ¨ ancora notevolmente costosa, vista la scarsa quantitàƒÂ  di molecola presente nella pianta ed il periodo piuttosto limitato della sua presenza nella pianta. Ecco perchàƒ© sono numerosi i gruppi di ricerca il cui principale obiettivo àƒ¨ quello di aumentare il contenuto in planta di artemisinina oppure di produrla in colture in vitro o mediante ingegnerizzazione di microrganismi. Gli studi finora condotti, per definire la via biosintetica dellࢠartemisinina hanno permesso di individuare diversi enzimi e i relativi geni. Tuttavia alcuni passaggi restano ancora da chiarire. Le colture in vitro rappresentano un valido strumento per uno studio approfondito delle vie biosintetiche di metaboliti vegetali, perchàƒ© permettono di operare in condizioni sperimentali ben definite e controllate. Lo scopo di questa tesi àƒ¨ stato quello di allestire diversi tipi di colture cellulari di Artemisia annua al fine di individuare il sistema piàƒ¹ idoneo alla produzione in vitro di artemisinina e di indagare sulla regolazione della via biosintetica, valutando lࢠespressione dei geni noti in colture in sospensione di A. annua, sottoposte a differenti trattamenti. Sono state allestite diverse tipologie di colture in vitro di Artemisia annua L. (colture di calli, cellule in sospensione e piantine micropropagate). Per aumentare il contenuto di artemisinina le colture in sospensione sono state elicitate con metil jasmonato, una molecola che stimola il metabolismo secondario e miconazolo, un inibitore della sintesi degli steroli, la via competitiva dei sesquiterpeni. Inoltre, le cellule sono state trattate con elicitori biotici come lࢠestratto fungino di Penicillium verrucosum. Attraverso analisi HPLC si àƒ¨ potuto osservare che i trattamenti hanno stimolato in misura differenziale la produzione di artemisinina. Il trattamento con metil jasmonato ha indotto un aumento massimo di 2,4 volte del contenuto di artemisinina dopo 4 ore di trattamento. Nel trattamento con miconazolo si àƒ¨ raggiunto il livello piàƒ¹ alto di artemisinina (1,6 volte) quando le cellule sono state trattate per 5 giorni alla concentrazione di 200 ?M. Lࢠanalisi dellࢠespressione genica, mediante Real Time PCR, ha permesso di studiare la regolazione di alcuni geni della via biosintetica dellࢠartemisinina. Lࢠanalisi dellࢠespressione in cellule in sospensione di Artemisia annua ha rivelato, un aumento dellࢠespressione dei geni CYP71AV1, CPR e Dbr2, codificanti rispettivamente per gli enzimi citocromo P450 monossigenasi, citocromo P450 reduttasi e aldeide artemisinica ?11(13) reduttasi. In particolare si àƒ¨ evidenziato un aumento dellࢠespressione di CYP71AV1 di circa 7 volte, dopo 30 min di trattamento con metil jasmonato. Nelle cellule trattate con miconazolo 200 ?M si àƒ¨ evidenziato un forte aumento dellࢠespressione del gene Dbr2, e di CPR rispettivamente dopo 30 min e 4 ore di trattamento. In questo lavoro di tesi àƒ¨ stato inoltre messo a punto il protocollo di isolamento di protoplasti sia da cellule in sospensione sia da piantine micropropagate di Artemisia annua. I protoplasti sono stati trasformati transientemente. Un altro aspetto della ricerca àƒ¨ stato volto ad identificare geni codificanti fattori di trascrizione in grado di influenzare la biosintesi di artemisinina. In particolare la nostra attenzione àƒ¨ stata focalizzata sulla famiglia di fattori di trascrizione WRKY. àƒ stato isolato un nuovo fattore WRKY in Artemisia annua denominato AaWRKY3. La sequenza di AaWRKY3 àƒ¨ stata utilizzata per creare un costrutto chimerico con tag fluorescente: WRKY:GFP, utilizzato per trasformare transientemente protoplasti di cellule in sospensione di A. annua. Il costrutto WRKY:GFP andava a localizzarsi specificamente nel nucleo, cosàƒ¬ come tutti i fattori di trascrizione.