Aspetti funzionali della compartimentalizzazione nucleare di proteine di citomegalovirus umano in un modello di infezione litica in vitro

Il nucleolo àƒ¨ un dominio nucleare coinvolto nella biogenesi dei ribosomi, cosàƒ¬ come in molte importanti attivitàƒÂ  regolatorie cellulari, tra cui il controllo del ciclo cellulare e i processi di maturazione e trasporto di mRNA. Inoltre, numerosi dati di letteratura descrivono un coinvolgimento del compartimento nucleolare durante il ciclo replicativo di molti agenti virali, tra cui i virus erpetici. Precedenti studi svolti dal nostro gruppo di ricerca su citomegalovirus umano (HCMV), hanno dimostrato lࢠaccumulo preferenziale a livello nucleolare (in particolare, anche a livello della matrice nucleolare) di una delle maggiori fosfoproteine (pp65) del tegumento virale nel modello sperimentale costituito da fibroblasti umani infettati liticamente; tale effetto era giàƒÂ  evidente a tempi molto precoci dopo lࢠinfezione. Il progetto di ricerca sviluppato e descritto in questa tesi sperimentale àƒ¨ stato rivolto alla valutazione delle possibili implicazioni funzionali (con particolare riferimento allࢠespletamento del programma di espressione litica virale) della localizzazione nucleolare della proteina pp65 di HCMV. Uno degli strumenti inizialmente impiegati per tale verifica àƒ¨ stato lࢠutilizzo di sostanze, quali actinomicina D e cisplatino, di cui àƒ¨ nota, qualora utilizzate a basse concentrazioni, una selettiva azione inibitoria sullࢠenzima RNA polimerasi I (lasciando invece inalterata lࢠattivitàƒÂ  di RNA polimerasi II e III) e, conseguentemente, sulla sintesi di RNA ribosomiale. In tali condizioni sperimentali àƒ¨ stata osservata una significativa ridistribuzione delle proteine nucleolari dal nucleolo al nucleoplasma ed una simultanea deplezione della proteina virale pp65 dal compartimento nucleolare; questo effetto era altamente evidente sia in monostrati di fibroblasti trattati per lࢠestrazione della matrice nucleare in situ, sia in cellule non trattate. In concomitanza a tali effetti, relativi alla deplezione nucleolare di pp65 ed allࢠinibizione dellࢠattivitàƒÂ  dellࢠenzima RNA polimerasi I, àƒ¨ stata di significativo interesse lࢠosservazione di un netto ritardo nellࢠavvio del programma litico di espressione genica virale. Questi risultati suggeriscono una possibile relazione tra la localizzazione nucleolare di pp65, la sintesi di rRNA, e la regolazione dellࢠespressione genica di HCMV. Tra le funzioni nucleolari di possibile interesse per HCMV ed eventualmente legate anche alla sintesi di rRNA, lࢠattenzione si àƒ¨ concentrata sul ciclo cellulare, la cui regolazione avviene anche a livello nucleolare e la cui modulazione da parte di HCMV àƒ¨ nota in diversi modelli sperimentali. I dati ricavati dallo studio di questo importante aspetto supportano lࢠipotesi di un ruolo potenzialmente rilevante di pp65, e della sua localizzazione nucleolare, nel controllo del ciclo cellulare da parte di HCMV (in grado di arrestare la proliferazione del modello cellulare utilizzato in fase G1-G1/S), e nel corretto avvio del programma litico virale. In particolare, i risultati ottenuti dimostrano che, sebbene lࢠingresso del virus nella cellula ospite non sia influenzato dalla fase metabolica in cui questa si trova, la localizzazione dellࢠantigene virale pp65 a livello del nucleolo àƒ¨ significativamente maggiore in cellule in fase G1 e G1/S, rispetto a quelle che si trovano in S o in G2/M. In concomitanza, àƒ¨ stato osservato che solo cellule in fase G1 o G1/S sono in grado di sostenere una corretta ed efficiente realizzazione del ciclo litico di HCMV, che risulta, invece, fortemente penalizzato in S e in G2/M. Tali osservazioni avvalorano ulteriormente lࢠipotesi di un possibile coinvolgimento di pp65 nei processi di regolazione e signaling correlati a funzioni nucleolari, come il controllo del ciclo cellulare. Al fine di individuare possibili partners molecolari con cui interagirebbe la proteina virale pp65 a livello del nucleolo, lࢠattenzione àƒ¨ stata rivolta allo studio di antigeni nucleolari di rilevanza nellࢠambito del controllo del ciclo cellulare (oltre che della sintesi di rRNA), come nucleolina (C23), nucleofosmina, fibrillarina e UBF (ࢠUpstream Binding Factorࢠ). Esperimenti di microscopia confocale e di coimmunoprecipitazione reciproca, hanno indicato C23 quale uno dei possibili partners molecolari di pp65 a livello nucleolare. Questa ipotesi àƒ¨ stata ulteriormente supportata da esperimenti di silenziamento genico di C23. Sebbene si tratti di dati preliminari, tuttavia essi sembrano confermare un chiaro coinvolgimento di tale proteina nucleolare nellࢠinterazione con la proteina pp65 di HCMV; infatti, in fibroblasti in cui era stato realizzato il silenziamento genico di C23, non si assisteva piàƒ¹ alla localizzazione nucleolare di pp65. Inoltre, lࢠespressione delle proteine precocissime maggiori di HCMV era significativamente inibita, non solo come efficienza, ma anche relativamente alla loro dislocazione cellulare, con assenza di accumulo nucleare e presenza delle stesse a livello citoplasmatico.