Synthesis of cysteine-reactive compounds as drugs or pharmacological tools

Lࢠimpiego di molecole reattive nei processi di drug discovey àƒ¨ spesso scoraggiato a causa della loro potenziale tossicitàƒ od instabilitàƒ metabolica. Infatti, se non adeguatamente indirizzata verso il bersaglio desiderato, la loro reattivitàƒ nei confronti di bersagli biologici alternativi o rispetto a nucleofili biologici come il glutatione (GSH) potrebbe tradursi in effetti tossici indesiderati. D'altra parte, composti reattivi in grado di legare selettivamente i loro recettori con interazioni covalenti potrebbero essere utili per il trattamento di molte malattie clinicamente rilevanti, nonchàƒ© per lo sviluppo di nuovi strumenti per lࢠindagine biologica o farmacologica. Allࢠinterno di questa classe di sostanze, i composti in grado di legare covalentemente i gruppi tiolici cisteinici rappresentano una delle classi piàƒ¹ promettenti per lo sviluppo di composti farmacologicamente sfruttabili. La reattivitàƒ specifica di questi composti nei confronti dei gruppi sulfidrilici fornisce loro la capacitàƒ di legare selettivamente i residui cisteinici esposti dal bersaglio designato limitando, nel contempo, la loro interazione con altri nucleofili presenti nell'ambiente biologico. Considerando che la cisteina àƒ¨ scarsamente espressa nella struttura primaria di molte proteine rispetto ad altri aminoacidi strutturali, solo un limitato sottoinsieme di bersagli biologici dovrebbe presentare residui cisteinici esposti al solvente disponibili ad essere legati da questa classe di composti. Inoltre, dal momento che àƒ¨ raro rilevare proteine non correlate che condividano uno stesso pattern di esposizione di residui cisteinici dopo il processo di folding, il microambiente esistente intorno ai residui cisteinici esposti puàƒ² essere sfruttato per sviluppare composti covalenti ad alta specificitàƒ , in grado di discriminare target biologici differenti fra le proteine esprimenti residui cisteinici accessibili. In questo modo, i composti sviluppati potrebbero essere utilizzati come ࢠtagging agentsࢠad alta specificitàƒ nel contesto della sperimentazione biologica ma anche, successivamente ad un incremento della loro stabilitàƒ metabolica e/o della loro specificitàƒ di azione ottenuto attraverso opportune ottimizzazioni strutturali, come farmaci. Farmaci cisteino-reattivi giàƒ in commercio quali la Fosfomicina (Monouril à,®), lࢠOmeprazolo (Antra à,®) ed il Disulfiran (Antabuse à,®), cosàƒ¬ come molti altri composti in fase di sperimentazione, rappresentano ottimi esempi di come composti in grado di legare covalentemente residui cisteina possano essere sfruttati a livello farmacologico. Durante lo svolgimento di questo progetto di Dottorato di Ricerca sono stati progettati e sintetizzati nuovi inibitori covalenti ad attivitàƒ cysteine-trap per il dominio Tyrosin Kinasico dellࢠEpidermal Growth Factor Receptor (EGFR-TK) e per lࢠenzima MonoAcylGlyceorol Lypase (MAGL). Entrambi questi enzimi presentano residui di cisteina esposti al solvente adatti ad essere legati da composti ad attivitàƒ cystene-trap opportunamente progettati. Lࢠinterazione covalente di questi composti con i loro relativi bersagli porta alla formazione di complessi farmaco-enzima sufficientemente stabili da produrre un binding irreversibile, o per lo meno di lunga durata, dei residui cisteinici bersaglio e quindi in grado di assicurare unࢠelevata occupazione recettoriale. Il binding covalente di EGFR-TK risulta essere utile per il trattamento di forme di cancro in cui l'espressione di una forma mutata di EGFR (T790M) àƒ¨ in grado di conferire farmaco-resistenza nei confronti dei convenzionali inibitori non covalenti di EGFR. In questi casi, il legame covalente con il residuo cisteinico Cys773 presente allࢠinterno del sito attivo di EGFR-TK comporta unࢠincrementata affinitàƒ di legame per il target, garantisce unࢠelevato livello di occupazione recettoriale e consente di superare il fenomeno della farmaco-resistenza. Lࢠaumento di affinitàƒ indotto dallࢠinstaurarsi dellࢠinterazione covalente fra questi composti ed un dato bersaglio biologico puàƒ² anche essere considerata come un buon punto di partenza per la messa a punto di studi SAR finalizzati allࢠottimizzazione strutturale dei composti considerati. In questo senso, infatti, la manipolazione strutturale di composti ad attivitàƒ covalente puàƒ² essere effettuata con un diminuito rischio di perdere affinitàƒ per il bersaglio designato. Questo concetto àƒ¨ stato applicato alla progettazione di nuovi inibitori cysteine-trap per MAGL. In questo caso, i composti sintetizzati sono stati progettati per presentare livelli elevati di diversitàƒ strutturale al fine di ottimizzare il loro fitting recettoriale. Tutti i composti sintetizzati nellࢠambito di questio progetto di Dottorato presentano una porzione cisteino-reattiva (warhead) di struttura variabile legata a diversi motivi strutturali non reattivi (driver groups) progettati per modulare il receptor fitting. Lࢠinibizione di EGFR-TK mediante composti ad attivitàƒ cysteine-trap àƒ¨ stata portata a termine utilizzando composti caratterizzati da un driver group di tipo 6-amino-4-(3-bromoanilino)chinazolinico collegato ad una piccola collezione di warheads, selezionate in modo da possedere un ampio spettro di meccanismi di interazione covalente. Per i composti sintetizzati àƒ¨ stata valutata la capacitàƒ di inibire il processo autofosforillativo di attivazione di EGFR come anche di inibire la proliferazione di popolazioni cellulari tumorali overesprimenti EGFR. Inoltre, al fine di valutare il loro potenziale terapeutico nei riguardi di tumori resistenti ai convenzionali inibitori non covalenti di EGFR, àƒ¨ stata indagata la loro efficacia nellࢠinibire la proliferazione cellulare in cellule tumorali esprimenti EGFR T790M. Lࢠinibizione di MAGL mediante composti ad attivitàƒ cysteine-trap cisteina àƒ¨ stata ottenuta variando sia le warheads sia i driver groups caratterizzanti i composti utilizzati. Dal momento che per tale scopo si sono utilizzate solamente tre tipologie di warhead eterocicliche, la variabilitàƒ dei gruppi cisteino-reattivi in questo studio SAR puàƒ² essere considerata modesta. Al contrario, al fine di esplorare lࢠintorno farmacoforico dei residui cisteinici bersaglio, la porzione driver àƒ¨ stata oggetto di una piàƒ¹ ampia manipolazione strutturale. Lࢠelevata potenza inibitoria fornita dai composti sintetizzati relativamente a EGFR-TK e MAGL àƒ¨ incoraggiante e dimostra come composti ad attivitàƒ cysteine-trap possano essere efficacemente utilizzati nellࢠambito dei processi di drug discovery. Inoltre, i bassi profili di citotossicitàƒ rilevati unitamente all'efficacia dimostrata di alcuni inibitori di EGFR-TK nellࢠinibire la proliferazione cellulare su linee tumorali resistenti mostra come tipi di warhead differenti possano essere impiegate per lo sviluppo di nuovi inibitori irreversibili di EGFR capaci di superare la farmaco-resistenza indotta dellࢠespressione di EGFR T790M con un migliorato rapporto di efficacia/tossicitàƒ .