Unraveling Mitochondrial Biogenesis in Saccharomyces cerevisiae: Genomics, Genetics and Biochemical Approaches

I mitocondri, oltre al classico ruolo di centrali energetiche delle cellule, sono organelli di vitale importanza in molti altri processi come invecchiamento e apoptosi. Esiste un esteso scambio di informazioni tra genoma nucleare e mitocondriale che permette di integrare il metabolismo mitocondriale nel network cellulare. Tutti i processi che concorrono nello stabilire una corretta funzionalità  mitocondriale e una sua corretta integrazione sono collettivamente noti come †œbiogenesi mitocondriale†�. Il lievito S. cerevisiae ਠstato uno degli organismi modello pi๠estensivamente utilizzati nella ricerca in campo mitocondriale e molti approcci sono stati utilizzati per identificare geni nucleari coinvolti nel metabolismo mitocondriale. Negli ultimi anni analisi high throghput sono diventate molto comuni ma nonostante la grande quantità  di informazioni raccolte il proteoma mitocondriale ਠancora lontano dall'essere completato. Abbiamo eseguito uno screening genomico incentrato sull'identificazione di geni nucleari coinvolti nella biogenesi mitocondriale. Tenendo presente che alcuni mutanti mitocondriali esprimono un fenotipo evidente solo in condizioni di stress e ipotizzando che le numerose analisi riportate in letteratura, condotte sempre alla temperatura ottimale di 30ºC, potessero aver sottostimato il numero di geni coinvolti, abbiamo eseguito le analisi alla temperatura di 37ºC. Utilizzando un terreno ricco in presenza di etanolo come fonte di carbonio e analizzando la crescita a 30 e 37ºC abbiamo identificato 488 geni la cui delezione comporta un difetto ossidativo. Attraverso un processo di filtraggio dei dati e conferme sperimentali abbiamo selezionato 177 geni mai correlati alla funzionalità  mitocondriale o la cui funzione fosse ancora parzialmente o totalmente sconosciuta. Per la maggior parte di questi il fenotipo osservato era specifico a 37ºC. Abbiamo inoltre dato una prima caratterizzazione del difetto OXPHOS analizzando lo stato dei citocromi respiratori e il consumo di ossigeno, raggruppando i candidati in quattro classi fenotipiche che descrivessero la severità  dei fenotipi osservati. Differenti fattori di trascrizione, modificatori istonici e pathway cellulari si sono rivelati arricchiti nel nostro dataset a 37ºC. Modificazione dei tRNA citoplasmatici, acetilazione N-terminale e pathway di risposta al pH alcalino sono tra gli identificati. Una importanza funzionale di questi processi nella biogenesi mitocondriale in condizioni di stress ਠstata quindi provata per la prima volta. Uno dei pathway pi๠interessanti ਠquello riguardante la modificazione di tRNA citoplasmatici nella posizione wobble dell'anticodone, arricchito a 37ºC. Per questo processo non era mai stata mostrata una connessione con la biogenesi mitocondriale. Abbiamo quindi esplorato la possibilità  che tRNA modificati da questo pathway potessero essere essenziali per la sintesi proteica mitocondriale a 37ºC. Studiando tre particolari mutanti in geni rappresentativi delle tre reazioni fondamentali di modificazione siamo stati in grado di dimostrare chiaramente che la sintesi proteica mitocondriale ਠregolata da questo pathway. Il meccanismo molecolare sottostante rimane perಠancora sconosciuto. Infine ਠstato caratterizzato funzionalmente un singolo gene la cui delezione ਠcausa di difetti OXPHOS a 37ºC. Codifica per una proteina mitocondriale a funzione sconosciuta partner ipotetico della ossidoreduttasi Arh1. Il mutante nullo nel gene YIR024C ਠstato sottoposto ad una estensiva caratterizzazione biochimica che ne ha messo in luce differenti difetti nella catena respiratoria mitocondriale. Le subunità  del complesso IV codificate nel genoma mitocondriale (Cox1, Cox2 e Cox3) e il Cytb si sono rivelati fortemente abbattuti a 37ºC come le attività  enzimatiche dei rispettivi complessi. Inoltre nelle stesse condizioni anche il profilo del heme mitocondriale mostrava difetti. Abbiamo costruito un ceppo in grado di esprimere una versione della proteina recante al suo C terminale un tag di riconoscimento. In questo modo ne abbiamo determinato la localizzazione mitocondriale, la topologia e il peso nativo. Queste analisi hanno confermato che Yir024c ਠuna proteina mitocondriale di membrana interna, che espone nello spazio intermembrana un dominio globulare di 152 aminoacidi. Il peso nativo si ਠrivelato essere circa 250Kda, indicativo di appartenenza ad un complesso proteico. L'ipotetico partner fisico Arh1 perಠnon ਠstato identificato nello stesso complesso e inoltre non ਠstata osservata alcuna co-precipitazione in studi di affinità . Questo ci ha permesso di concludere che i due prodotti proteici non interagiscono fisicamente. Per identificare i partner funzionali di Yir024c il complesso di 250Kda ਠstato purificato e sottoposto ad analisi di spettrometria di massa, ancora in corso di svolgimento.