Female infertility: in vitro maturation of antral oocytes upon a feeder layer of selected cumulus cells improves developmental competence

Secondo l'organizzazione mondiale della sanità  (WHO) l'infertilità  colpisce circa il 20% delle coppie nei paesi occidentali. A questo dato si aggiunge un numero sempre pi๠crescente di donne (280.000/anno, Stati Uniti e 58.000/anno, Italia) che, sottoponendosi a trattamenti chemio/radio terapici, sviluppa sindrome da prematuro decadimento ovarico. L'isolamento e la crioconservazione di oociti immaturi denudati (DOs) ਠuna possibile strategia impiegata per preservare la fertilità  di queste pazienti, in particolare quando i DOs sono coltivati fino a metafase II in presenza di un feeder layer di cellule del cumulo (FL-CCs). Durante il mio dottorato, ho messo a punto un nuovo sistema miniaturizzato di coltura in vitro di DOs su un FL di CCs selezionate in base alla loro appartenenza a oociti competenti o incompetenti allo sviluppo. Due sono stati i principali obiettivi della mia ricerca: 1. Testare l'ipotesi che la selezione delle CCs possa avere un effetto migliorativo sulle rese di sviluppo. Classificando CCs in base alla loro associazione con oociti antrali competenti (SN) o incompetenti (NSN) allo sviluppo, abbiamo preparato, in delle micro-Insert 4 well plates, un FL di SN-CCs o NSN-CCs. Abbiamo dimostrato, cosà¬, che la maturazione di DOs su FL-SN-CCs contribuisce significativamente all'acquisizione della competenza meiotica e di sviluppo, con una percentuale di blastocisti (26.9%) simile a quella ottenuta dalla maturazione di follicoli integri (28%). Al contrario, quando i DOs sono maturati in assenza di CCs (NO-FL) o su FL-NSN-CCs vanno incontro ad un blocco della ripresa meiotica e dello sviluppo, con arresto degli embrioni agli stadi di 4 cellule o morula. 2. Identificazione dell'intervallo di tempo, durante la fase maturativa, in cui il feeder layer SN-FL-CCs influenza maggiormente l'acquisizione della competenza allo sviluppo dell'oocita. A tal fine, ho coltivato DOs secondo tre diverse condizioni sperimentali: 1. in assenza di FL-SN-CCs per 3 hr e su FL-SN-CCs per le successive 12 hr; 2. in assenza di FL-SN-CCs per 6 hr e su FL-SN-CCs per le successive 9 hr; 3. su SN-FL-CCs per 6 hr ed in assenza di FL-SN-CCs per le successive 9 hr. Quando i DOs sono stati coltivati seguendo il protocollo 1, lo sviluppo da 2 a 4 cellule ਠrimasto simile a quello ottenuto quando i DOs sono stati coltivati su FL-SN-CCs per tutte le 15 hr di coltura, suggerendo una corretta transizione oocita-embrione. Al contrario, le rese di blastocisti sono diminuite significativamente, indicando un'alterazione di processi chiave dello sviluppo pre-impianto. Inoltre, se l' assenza di CCs veniva prolungata per 6 hr, nessun embrione raggiungeva lo stadio di blastocisti. Ancor pi๠dannosa ਠstata l'assenza del FL-SN-CCs nelle ultime 9 hr di coltura, portando ad un completo arresto dello sviluppo a 2 cellule. I risultati di questi tre set di esperimenti suggeriscono la presenza di un importante fattore/i paracrino/i rilasciato da FL-SN-CCs, presumibilmente nel terreno di coltura, la cui assenza risulta esser dannosa per l'acquisizione della competenza allo sviluppo dell'oocita. In conclusione, mentre le cellule SN contribuiscono positivamente nel determinare l'acquisizione della competenza meiotica e di sviluppo embrionale, la mancanza di questo supporto, riscontrabile sia in presenza di un FL di cellule NSN sia in assenza di FL, porta al fallimento della capacità  meiotica e di sviluppo dell'oocita. Inoltre, i nostri risultati hanno posto le basi per meglio comprendere quali siano le molecole coinvolte nella comunicazione bidirezionale tra le cellule del cumulo ooforo ed il gamete durante il passaggio dallo stadio di vescicola germinale a quello di metafase II.