Metodi molecolari per la diagnosi di laboratorio e lo studio epidemiologico delle infezioni da Giardia intestinalis, Cryptosporidium spp. e Dientamoeba fragilis

Le malattie gastrointestinali sostenute da protozoi patogeni a trasmissione fecale-orale hanno un rilevante impatto in termini di morbilitàƒÂ  e mortalitàƒÂ  in tutto il mondo, con prevalenza particolarmente elevata nei Paesi in via di sviluppo. Tuttavia, tali infezioni sono diventate un problema non trascurabile per i Paesi industrializzati quali il nostro, in relazione al progressivo e costante aumento di soggetti che per ragioni diverse (turismo, lavoro, opere missionarie, etc.) si recano in aree iperendemiche e ai flussi migratori provenienti dalle stesse, oltre che allࢠadozione. Il nostro laboratorio infatti riceve numerosi campioni di questi soggetti e di italiani apparentemente privi di fattori di rischio, per i quali non àƒ¨ possibile escludere casi autoctoni di infezione. Tra i protozoi piàƒ¹ frequentemente implicati nelle parassitosi intestinali, oltre allࢠameba Entamoeba histolytica agente di amebiasi intestinale e viscerale, vi sono due protozoi riconosciuti come agenti di gastroenterite, G. intestinalis e Cryptosporidium spp., e D. fragilis, protozoo a prevalenza crescente nei Paesi industrializzati con ruolo patogeno inizialmente controverso ma ormai chiarito. La diagnosi di parassitosi intestinale, che prevede indagini convenzionali basate sullࢠanalisi di caratteristiche morfo-strutturali e comprendenti lࢠesame microscopico, la coltura per protozoi ed elminti e la ricerca di antigeni, presenta limiti dovuti alla necessitàƒÂ  di personale addestrato e alle difficoltàƒÂ  intrinseche dellࢠesame parassitologico legate prevalentemente alla scarsa sensibilitàƒÂ  e/o specificitàƒÂ  dei singoli metodi. Recentemente sono stati sviluppati e proposti diversi saggi di PCR, convenzionale e/o real-time, per la diagnosi di parassitosi intestinale, volti al superamento di tali limiti. Nel nostro laboratorio, dove àƒ¨ da tempo in atto un progetto di ricerca applicato alla diagnostica innovativa delle parassitosi e, in particolare, di quelle intestinali, àƒ¨ giàƒÂ  stato sviluppato ed estesamente valutato un saggio molecolare per la diagnosi di amebiasi, con conseguente vantaggiosa applicazione nella pratica diagnostica quotidiana. In questo campo di ricerca applicata si inserisce lo scopo di questo studio che si propone di valutare 3 saggi di real-time PCR per la diagnosi di infezione da G. intestinalis, Cryptosporidium spp. e D. fragilis, rispettivamente, finalizzato alla potenziale applicazione nella pratica diagnostica quotidiana e alla definizione della reale prevalenza dei 3 protozoi nella realtàƒÂ  considerata, che si ipotizza sottostimata in quanto influenzata dai limiti della diagnosi mediante metodi convenzionali. I saggi di real-time PCR, aventi come bersaglio i geni codificanti per lࢠRNA ribosomiale dei 3 protozoi, sono stati valutati utilizzando campioni di feci appartenenti a pazienti con sospetta parassitosi intestinale inviati presso il nostro laboratorio, a confronto con i risultati ottenuti mediante metodi convenzionali di diagnosi parassitologica, quali lࢠesame microscopico diretto e previo arricchimento, la ricerca degli antigeni specifici di G. intestinalis e Cryptosporidium spp. mediante saggio immunocromatografico e reazione di immunofluorescenza e la coltura per protozoi per quanto riguarda la ricerca di D. fragilis. I campioni utilizzati per la valutazione dei saggi molecolari erano complessivamente 2770 di 1410 pazienti nel periodo 2006-2010. In particolare, sono stati analizzati 771 campioni di 386 pazienti inviati dal 2006 al 2008, 1040 campioni di 533 pazienti inviati dal 2006 al 2010, 959 campioni di 491 pazienti inviati dal 2006 ad Aprile del 2009, per la valutazione dei saggi per la diagnosi di infezione da G. intestinalis, Cryptosporidium spp. e D. fragilis, rispettivamente. Da un punto di vista analitico i 3 saggi di real-time PCR valutati si sono rivelati altamente sensibili e specifici dimostrando un limite di rivelazione corrispondente ad un ridotto numero di stadi diagnostici (cisti di G. intestinalis e Cryptosporidium spp., trofozoiti di D. fragilis) nel campione di feci e assenza di reattivitàƒÂ  crociata con il DNA di altri parassiti. I saggi di real-time PCR per la diagnosi di infezione da G. intestinalis, Cryptosporidium spp. e D. fragilis valutati in questo studio si sono dimostrati altamente sensibili e specifici, non solo da un punto di vista analitico ma anche da un punto di vista diagnostico, in quanto oltre a confermare i casi diagnosticati mediante metodi convenzionali hanno rilevato casi aggiuntivi; in particolare hanno rispettivamente permesso di diagnosticare 13 casi aggiuntivi di giardiasi su un totale di 106, 1 caso aggiuntivo di criptosporidiosi su un totale di 13, 60 casi aggiuntivi di dientamoebiasi su un totale di 105. I dati ottenuti dalla valutazione hanno inoltre permesso di delineare la reale prevalenza di G. intestinalis, Cryptosporidium spp. e D. fragilis, identificandoli come i 3 protozoi patogeni piàƒ¹ frequenti tra i pazienti con sospetta parassitosi intestinale nella nostra realtàƒÂ . Il saggio di real-time PCR per la diagnosi di infezione da D. fragilis, in particolare, si àƒ¨ dimostrato di grande utilitàƒÂ  ed adeguato per lࢠapplicazione alla pratica diagnostica quotidiana, in quanto quasi il 60% dei casi àƒ¨ stato rilevato mediante il solo saggio molecolare. Di particolare interesse àƒ¨ il risultato ottenuto relativamente al sequenziamento dei campioni positivi per D. fragilis, tra i quali 5 campioni presentavano una sequenza potenzialmente attribuibile al genotipo 2 ad oggi riconosciuto in soli 2 isolati al mondo. La raritàƒÂ  del genotipo 2 e i risultati ottenuti nel presente studio aprono la base a futuri studi mirati alla determinazione di eventuali differenze nelle modalitàƒÂ  di trasmissione e nelle manifestazioni cliniche, tra i due genotipi noti. I saggi di real-time PCR per la ricerca del DNA di G. intestinalis e Cryptosporidium spp., invece, non si sono rivelati nella nostra esperienza sufficientemente vantaggiosi rispetto ai metodi convenzionali; pertanto la loro applicazione in diagnostica potrebbe essere utile in futuro solo se inclusi in una reazione di tipo multiplex, con conseguenti vantaggi in termini di costo e di minore complessitàƒÂ  dellࢠallestimento. àƒ stata inoltre compiuta la genotipizzazione dei ceppi di G. intestinalis identificati in questo studio, volta allࢠidentificazione dei genotipi A e B, gli unici riscontrabili nellࢠuomo, eseguita attraverso lࢠanalisi del polimorfismo nella lunghezza dei frammenti di restrizione del gene codificante per la proteina ?-giardina del protozoo. La genotipizzazione di G. intestinalis ha mostrato un risultato compatibile con i dati europei ma in contrasto con i dati italiani, rivelando una maggiore prevalenza del genotipo B (66,2%) rispetto al genotipo A (33,8%), sebbene non sia stato possibile genotipizzare una parte dei campioni, probabilmente a causa del fatto che il bersaglio di amplificazione àƒ¨ presente in singola copia nel genoma del protozoo e/o di potenziali ࢠmismatchesࢠnelle sequenze complementari ai primer. In futuro eseguendo la genotipizzazione basandosi sullࢠanalisi dei polimorfismi di diversi geni contemporaneamente potranno essere completati gli studi di genotipizzazione del protozoo chiarendo le differenze al momento osservate tra i nostri dati in accordo con quelli europei e i dati di altri studi italiani. I risultati di questo studio hanno messo a disposizione saggi pronti allࢠapplicazione in diagnostica e dati importanti relativi allࢠepidemiologia delle infezioni da G. intestinalis, Cryptosporidium spp. e D. fragilis ed infine hanno contribuito ad estendere conoscenze sulla distribuzione nella nostra realtàƒÂ  dei genotipi di G. intestinalis e di D. fragilis che infettano lࢠuomo.