Modulazione farmacologica del trasporto inverso del colesterolo: studi in vivo ed in vitro dell'effetto inibitorio della Ciclosporina A.

Il trasporto inverso di colesterolo macrofagico (RCT) ਠil processo con il quale il colesterolo ਠrimosso dalle cellule schiumose delle placche aterosclerotiche nelle pareti arteriose, trasportato tramite le lipoproteine ad alta densità  (HDL) nella circolazione, captato dal fegato ed infine eliminato con la bile e le feci.Tale processo ਠriconosciuto essere protettivo per lo sviluppo dell'aterosclerosi. Numerose dimostrazioni indicano che il rischio cardiovascolare ਠaumentato in pazienti che hanno subito trapianto di organo e sono in trattamento con il farmaco immunosoppressore Ciclosporina A (CsA). Al fine di indagare eventuali effetti della CsA sull'RCT in vivo, abbiamo trattato 10 topi C57BL/6 per 14 giorni con CsA al dosaggio di 50 mg/kg/die, o con il solo veicolo, mediante iniezione sottocutanea e, al termine del trattamento, abbiamo misurato l'efficienza del processo di RCT macrofagico servendoci di una metodica radio isotopica. I risultati ottenuti mostrano come il processo di RCT risulti alterato dopo il trattamento dei topi con il farmaco. Abbiamo inizialmente indagato se l'inibizione dell'RCT fosse a carico della prima tappa del processo: l'efflusso di colesterolo dai macrofagi. I risultati ottenuti da esperimenti in vitro di valutazione della capacità  delle cellule di rilasciare il colesterolo mediante diversi trasportatori di membrana dopo trattamento con CsA, e della capacità  del plasma dei topi trattati o meno con CsA di stimolare l'efflusso di colesterolo dalle cellule, non hanno mostrato alcuna attività  inibitoria da parte del trattamento con il farmaco. Mediante esperimenti in cellule epatiche (Fu5AH), abbiamo dimostrato che il trattamento dei topi con CsA ha invece alterato la seconda tappa dell'RCT, inibendo la captazione di colesterolo mediato dal Recettore Scavenger BI (SR-BI), dopo esposizione delle stesse a plasma di topi trattati. Inoltre abbiamo dimostrato che il trattamento con CsA porta a riduzione anche della terza tappa dell'RCT, l'escrezione di colesterolo nelle feci. Per approfondire come la CsA esplichi tale azione inibitoria, abbiamo analizzato, in campioni epatici dei topi trattati o meno, l'espressione genica dei trasportatori responsabili dell'escrezione di colesterolo nella bile, i trasportatori ATP-Binding Cassette G5 e G8 (ABCG5/G8), e dell'enzima colesterolo-7-?-idrossilasi (CYP7?), coinvolto nella conversione del colesterolo in acidi biliari. Analisi di RT-PCR hanno evidenziato una assenza di effetti negativi nell'espressione dell'mRNA dei trasportatori e una riduzione significativa dell'espressione del Cyp7?, nei topi trattati con il farmaco. L'analisi dell'espressione proteica dei trasportatori non ha mostrato alcuna differenza tra I topi trattati con CsA e quelli non trattati. Abbiamo ripetuto le analisi in campioni intestinali, in cui ABCG5/G8 sono responsabili dell'escrezione di colesterolo dal plasma al lume intestinale, e abbiamo misurato anche l'espressione genica del trasportatore responsabile del riassorbimento di colesterolo intestinale, la proteina Niemann Pick C1-Like 1 (NPC1L1). I risultati ottenuti dall'analisi sia di Abcg5/g8 che di Npc1l1, non hanno mostrato differenze significative tra i topi del gruppo controllo e trattato con CsA. Abbiamo inoltre effettuato esperimenti in vitro per indagare se la CsA, non alterando l'espressione genica di ABCG5/G8, causa inibizione dell'attività  di ABCG5/G8 nell'intestino. Mentre esperimenti in vitro di efflusso di colesterolo nella parte apicale di cellule CACO2 hanno mostrato una inibizione del trasporto di colesterolo attraverso ABCG5/G8 dopo trattamento delle cellule con CsA, la quantificazione del ?†"sitosterolo nel plasma dei topi trattati con CsA ha mostrato quantitativi simili tra gli animali dei due gruppi. In conclusione, questi risultati indicano che il trattamento CsA altera in vivo il processo di RCT macrofagico, in particolare mediante l'inibizione della seconda e terza tappa del processo, la captazione epatica del colesterolo e la sua escrezione fecale, senza agire sulla prima tappa, l'efflusso di colesterolo dai macrofagi. I nostri risultati indicano che l'effetto negativo si esplica principalmente attraverso l'inibizione del trasporto di colesterolo mediante SR-BI epatico e della sintesi degli acidi biliari mediante il CYP7?.