Biosonde a cellule per l'identificazione dei pericoli chimico-tossicologici negli alimenti

La contaminazione della catena di produzione alimentare puಠessere sia di origine naturale (ad es. micotossine) che di origine antropica (ad es. pesticidi, antibiotici ad uso veterinario, monomeri rilasciati da materiali plastici). In questo progetto di Dottorato ਠstato studiato e testato l'impiego di biosonde a cellule per l'identificazione dei pericoli chimico-tossicologici negli alimenti, mediante l'impiego di tre biosonde: 1) amperometrica a cellule di lievito; 2) ottica a cellule batteriche; 3) potenziometrica a cellule di origine mammifera: 1. Biosonda amperometrica a cellule wild type (wt) e modificate di Saccharomyces cerevisiae. E' stata studiata l'interferenza sulla respirazione aerobica cellulare per diverse dosi e tempi d'esposizione a bisfenolo A e B, monomeri di materiali plastici per alimenti, all'agro-erbicida diuron e a conservanti del legno (a base di metalli pesanti) utilizzati ad es. per i pali di sostegno in viticoltura: †¢ Bisfenolo A e B (5 †" 100 ppm; esposizione 24 h); i risultati ottenuti con cellule wt esposte mostrano due tipi di interferenza: (a) di tipo iperstimolatorio (capacità  respiratoria oltre la massima); (b) di tipo inibitorio (riduzione della capacità  respiratoria). Il trend di interferenza respiratoria ottenuto porta ad ipotizzare, con il supporto della letteratura, il coinvolgimento di meccanismi di: i) disaccoppiamento della fosforilazione ossidativa; ii) danno ossidativo mitocondriale. †¢ Diuron (10-10 - 10-6 M; esposizione 6 e 24 h); i risultati ottenuti con cellule wt mostrano a 6 h di esposizione a 10-10 - 10-7 M una parziale inibizione della respirazione cellulare (~11-13%) e nessun effetto a 10-6 M, mentre a 24 h di esposizione si ha un parziale recupero della attività  respiratoria fino a 10-7 M (~ 7-12%), mentre compare un effetto inibitorio (~6%) per 10-6 M. Tali risultati, con il supporto della letteratura, portano ad ipotizzare il coinvolgimento di tre meccanismi: i) tossicità , ii) detossificazione e iii) riparazione cellulare; †¢ Conservanti del legno a base di metalli pesanti; i risultati ottenuti con cellule modificate (sferoplasti), i cui effetti sembrerebbero legati alla comparsa di uno stress ossidativo mitocondriale, mostrano un aumento della sensibilità  delle cellule. 2. Biosonda ottica a cellule wt e transgeniche di Escherichia coli per la rilevazione di ciprofloxacina (antibiotico chinolonico ad uso veterinario) nel latte bovino Sono stati utilizzati due differenti ceppi batterici di E. coli (ATCC 11303 e DH5?) e diverse metodologie. Con il ceppo wt E. coli ATCC 11303 sono stati effettuati test di proliferazione cellulare con i seguenti metodi: †¢ spettrofotometrico di monitoraggio dell'induzione del'attività  enzimatica della ?-galattosidasi; †¢ fluorimetrico di monitoraggio del fluoroforo mCherry con espressione genica modulata dal promotore lac lattosio inducibile. Con il primo sono stati ottenuti risultati migliori per rapidità  di risposta (60 min) in presenza di ciprofloxacina 1 x LMR (limite massimo residuale). Con il coli ceppo E. coli DH5? ingegnerizzato (bioreporter inducibile) sono stati effettuati test fluorimetrici di monitoraggio del fluoroforo mCherry (modulato dal promotore yorB chinolone inducibile). La messa a punto del protocollo sperimentale ha consentito di ridurre interferenze osservate ed ottenere risposte significative dopo 120 min per le colture esposte a ciprofloxacina 20 x LMR e dopo 180 min per colture esposte a ciprofloxacina 1x LMR; l'utilizzo del fluoroforo Green Fluorescent Protein non ha mostrato miglioramenti nel metodo. 3. Biosonda potenziometrica a cellule Vero modificate per inserzione di anticorpi per la rilevazione di aflatossina B1 (AFB1) Tale sonda ਠstata sviluppata presso l'Agricultural University of Athens (BERA System). In particolare sono state modificate (per inserzione di anticorpi anti-AFB1) cellule Vero, adoperate per misure potenziometriche in presenza di AFB1. In base ai risultati ottenuti la biosonda sembra essere in grado di rilevare la presenza di AFB1 in concentrazione 2-20 ppb.