La Nutlin-3 potenzia l'effetto citotossico del trattamento combinato con gli inibitori di MEK1 e l'arsenico triossido in cellule di Leucemia Acuta

Nelle cellule primarie di Leucemia Mieloide Acuta (AML), il pathway Ras/Raf/MAPK ਠspesso costitutivamente attivato, conferendo alle cellule vantaggi in termini di sopravvivenza e proliferazione; il blocco di MEK inibisce crescita e proliferazione cellulare e down-regola l'espressione di numerosi fattori anti-apoptotici, riducendo cosଠla soglia apoptotica; tuttavia il blocco di MEK rende le cellule leucemiche sensibili, in maniera efficiente e selettiva, a dosi sub-ottimali di numerosi agenti anticancro, sia convenzionali che innovativi. Proprio in questo contesto ਠstato dimostrato che inibitori di MEK (PD184352, PD98059, PD325901) sensibilizzano blasti primari AML all'apoptosi indotta da Triossido di Arsenico (ATO) via p73, paralogo di p53, e l'attivazione del pathway pro-apoptotico di Bad. Inoltre ਠstato anche dimostrato che alte dosi di ATO (2microM) inducono l'accumulo di p53, con un incremento di pi๠del doppio rispetto al controllo, in 11 su 21 pazienti (52%), indicando un possibile contributo del pathway di p53 nell'induzione dell'apoptosi in seguito al trattamento combinato PD+ATO sui blasti. Mutazioni di TP53 sono piuttosto rare in AML (5-10%) e MDM2 (murine double minute 2), il suo principale gene regolatore, ਠfrequentemente stato trovato overespresso in AML, processo questo che puಠaumentare attivamente il potenziale tumorigenico e la resistenza all'apoptosi. Dato che, in cellule AML, gli inibitori di MEK possono aumentare la funzione proapoptotica nucleare di p53 oltre a quella di p73, lo scopo di questo studio ਠstato quello di investigare se la Nutlin-3, una piccola molecola antagonista di MDM2, potente e selettiva, poteva potenziare l'effetto apoptotico degli inibitori di MEK in combinazione con ATO, nelle cellule AML che overesprimono MDM2 e con p53 wild type. L'apoptosi ਠstata valutata tramite saggi di misurazione del contenuto di DNA Sub-G1, legame con annessina V e valutazione del potenziale mitocondriale transmembrana. Abbiamo prima analizzato le interazioni farmacologiche tra Nutlin-3, PD e ATO (0, 0.25, 0.5, 1, 2, 5, or 10 micro M) usando una fixed-ratio (1:1:1 o 1:2:4) su cellule AML OCI-AML-3 e MOLM-13, entrambe con una p53 wild-type. Abbiamo osservato che la combinazione dei tre farmaci (NUT/PD/ATO) ha mostrato un pi๠forte sinergismo citotossico rispetto alla combinazione PD/ATO indicando che l'inibizione dell'interazione tra p53 e MDM2, mediata dalla Nutlin-3, puಠinfluenzare positivamente l'effetto pro-apoptotico delle cellule trattate con PD e ATO: l'indice di combinazione medio (CI) calcolati dall'ED50 (50% effective dose), ED75 e ED90, con NUT/PD/ATO rispetto a cellule trattate con PD/ATO ਠ0.36± 0.03 contro 0.72±0.02 e 0.28±0.11 contro 0.50±0.15 rispettivamente per le OCI-AML-3 e per le MOLM-13. Al fine di indagare gli effettori molecolari coinvolti nell'apoptosi indotta da Nultina/PD/ATO o da PD/ATO, abbiamo inizialmente studiato la cinetica di p53, p73 a 2, 12, 24, e 48 ore nelle cellule OCI-AML-3 e MOLM-13. In assenza di Nutlin-3, ATO, anche ad alte dosi, non promuoveva un accumulo di p53 mentre modulava l'espressione genica di p73 attraverso l'induzione del isoforma pro-apoptotica e anti-proliferativa TAp73, e delle isoforma anti-apoptotica e pro-proliferativa ?Np73, mantenendo in questo modo inalterato il rapporto TA/ ?Np73. Al contrario, il trattamento con PD riduceva i livelli di ?Np73 e fermava l'up-regolazione ATO mediata di ?Np73 causando cosଠun incremento del rapporto TA/?Np73 nelle cellule sottoposte a doppio trattamento (PD/ATO). In particolare, in cellule AML trattate con PD/ATO, l'aggiunta di Nutlin-3 non solo aumenta i livelli della proteina p53 ma anche induceva una forte riduzione di ?Np73, dominante negativo di p53 wild-type e TAp73, portando ad un aumento di espressione dei geni target di p73/p53 come P53AIP1 e Puma e la perdita del potenziale di membrana mitocondriale. Infine, abbiamo dimostrato che la Nutlin-3 aumentava significativamente l'attività  antileucemica del PD/ATO nella maggior parte dei blasti leucemici provenienti da 14 diversi casi di AML analizzati ex vivo. Nel complesso questi risultati suggeriscono che il pathway pro-apoptotico p73, coinvolto nell'efficacia del trattamento PD/ATO, puಠessere potenziato dall'attivazione del pathway p53 in cellule AML che possiedono un pathway p53 funzionale e fornisce una spiegazione razionale per una effettiva e relativamente specifica strategia terapeutica per la AML.