Ruolo di Clusterina nella progressione del tumore prostatico

Clusterina (CLU) ਠuna proteina ubiquitaria, presente nella maggior parte dei fluidi corporei e implicata in svariati processi fisiologici. Dalla sua scoperta fino ad oggi, CLU ਠrisultata essere una proteina enigmatica, la cui funzione non ਠancora stata compresa appieno. Il gene codifica per 3 varianti trascrizionali identificate nel database NCBI con i codici: NM_001831 (CLU 1 in questo lavoro di tesi), NR_038335 (CLU 2 in questo lavoro di tesi) e NR_045494 (CLU 3 in questo lavoro di tesi). Tutte le varianti sono trascritte come pre-mRNA contenenti 9 esoni e 8 introni e si differenziano per l'esone 1, la cui sequenza ਠunica e caratteristica di ogni variante. Sebbene in NCBI sia annotato che le varianti CLU 2 e CLU 3 non sono codificanti, tramite analisi bioinformatica ਠstato predetto che da tutti e tre i trascritti possono generarsi proteine di differente lunghezza e localizzazione cellulare. Tra tutte le forme proteiche ipotizzate, l'unica a essere stata isolata e sequenziata ਠquella tradotta dall'AUG presente sull'esone 2 che dà  origine a una proteina di 449 aminoacidi. Il processo di maturazione prevede la formazione di un precursore citoplasmatico (psCLU) che subisce modificazioni post-traduzionali tra cui formazione di ponti disolfuro, glicosilazioni, taglio in due catene denominate ? e ? prima di essere secreta come eterodimero ?? (sCLU) nell'ambiente extracellulare, dove esercita la sua funzione di chaperone ATP-indipendente. Oltre alla forma extracellulare, ਠpossibile osservare una forma intracellulare con localizzazione citosolica la cui funzione non ਠstata ancora completamente chiarita. Questo lavoro di tesi si ਠprefissato lo scopo di incrementare le conoscenze in merito ai trascritti CLU 1 e CLU 2 e alla loro regolazione, oltre ad approfondire il ruolo della forma citosolica della proteina in relazione al signaling di NF-kB che svolge un ruolo importante nel processo di sviluppo e metastatizzazione del tumore. Nella prima parte, uno screening di differenti linee cellulari, quali cellule epiteliali di prostata e di mammella, sia normali sia tumorali, fibroblasti di origine polmonare e linfociti di tumore non-Hodgkin, ha permesso di caratterizzare i trascritti CLU 1 e CLU 2. Dall'analisi ਠemerso che la sequenza di CLU 1 ਠpi๠corta al 5' rispetto a quella depositata in NCBI con l'identificativo NM_001831 e il primo AUG disponibile per l'inizio della traduzione ਠlocalizzato sull'esone 2. àˆ stato dimostrato che CLU 2, al contrario di quanto riportato in NCBI, ਠtradotto in proteina a partire dall'AUG presente sull'esone 2, allo stesso modo in cui viene tradotto CLU 1. Inoltre, ਠstato osservato che i livelli d'espressione dei trascritti variano notevolmente tra le diverse linee cellulari e nelle cellule epiteliali CLU 2 ਠespressa sempre a bassi livelli. In queste cellule, l'espressione di CLU 2 ਠsilenziata per via epigenetica e la somministrazione di farmaci capaci di rendere la cromatina pi๠accessibile, quali tricostatina A e 5-aza-2'-deossicitidina, ਠin grado di incrementarne l'espressione. Nella seconda parte, un'analisi bioinformatica seguita da saggi di attività  in vitro in cellule epiteliali prostatiche trattate con farmaci epigenetici, hanno permesso di identificare, per la prima volta in uomo, una seconda regione regolatrice denominata P2, capace di controllare l'espressione di CLU 2. Rispetto a P1, il classico promotore di CLU già  ampiamente studiato da altri gruppi di ricerca, P2 ਠun promotore debole, privo di TATA box, che nelle cellule epiteliali prostatiche ਠsilente in condizioni basali e la cui attività  incrementa in seguito alla somministrazione di farmaci epigenetici capaci di alterare le modificazioni post-traduzionali delle code istoniche nell'intorno di P2. Ne consegue un rilassamento della cromatina e un successivo aumento di trascrizione di CLU 2. La presenza di un'isola CpG differentemente metilata nell'intorno di P1 spiegherebbe, almeno in parte, i differenti livelli di espressione di CLU che si osservano tra le diverse linee cellulari. Nella terza parte, l'analisi del pathway di NF-kB in un modello sperimentale di tumore prostatico in cui CLU ਠstata silenziata o sovraespressa, ha permesso di capire come la forma citosolica di CLU abbia un ruolo inibitorio nei confronti dell'attività  del fattore trascrizionale NF-kB. CLU inibisce la fosforilazione e l'attivazione di p65, il membro pi๠rappresentativo della famiglia NF-kB, con conseguente riduzione della trascrizione di alcuni geni da esso regolati e coinvolti nel rimodellamento della matrice extracellulare, quali l'urochinasi attivatrice del plasminogeno, la catepsina B e la metallo proteinasi 9. àˆ stato dimostrato che tale inibizione non ਠdovuta a un'interazione fisica diretta tra CLU e p65, per cui si suppone che CLU interagisca con uno dei componenti pi๠a monte della via di segnalazione responsabile della fosforilazione ed attivazione di p65.