From molecule to cell: investigation of DNA architecture by Atomic Force and Fluorescence microscopy

Negli organismi viventi l'organizzazione spaziale dell'informazione genetica codificata nella molecola di acido desossiribonucleico (DNA), necessita del giusto equilibrio tra le caratteristiche fisiche della molecola e le esigenze biologiche della cellula. Il DNA ਠun polimero estremamente lungo se paragonato alle dimensioni della cellula e necessita quindi di un elevato grado di compattamento per essere contenuto all'interno dell'involucro cellulare. La compattazione del DNA, tuttavia, ਠin contrasto con il suo ruolo biologico in quanto svariate classi di enzimi devono avere accesso all'informazione per lo svolgimento dei processi vitali. Nelle cellule si instaura quindi un sistema regolativo che si estende dalla dimensione nanoscopica propria delle molecole che mediano i processi biologici a livello del DNA, fino alla dimensione microscopica degli organelli cellulari. Nel corso del dottorato mi sono occupato dello studio dell'organizzazione spaziale del DNA sia a livello molecolare che cellulare. In particolare mi sono occupato di due fattori trascrizionali di Helicobacter pylori, HpFur e HpNikR, che modulano l'architettura ed il grado di compattazione del DNA facilitando o ostacolando l'accessibilità  della RNA polimerasi alla sequenza del promotore del gene arsR . I dati raccolti ci hanno permesso di sviluppare un modello molecolare nel quale in presenza di ferro HpFur ਠin grado multimerizzare e di indurre una compattazione di tutta la sequenza promotrice, impedendo in questo modo il legame della RNA polimerasi al DNA. In assenza di ferro invece, HpFur cambia la propria struttura quaternaria e lega una sequenza a monte del promotore consentendo il legame della RNA polimerasi al promotore. Il fattore trascrizionale HpNikR ਠin grado di legare il DNA solo in presenza di nichel ed ਠin grado di limitare la propagazione della compattazione del promotore, mediata da HpFur in presenza di ferro. Questo circuito regolativo permette a Helicobacter pylori di controllare finemente la sintesi di HpArsR a seconda della disponibilità  dei cofattori metallici. Durante il dottorato mi sono anche occupato di valutare l'organizzazione tridimensionale dell'intero genoma dell'organismo modello Escherichia coli. A differanza di numero studi presenti in lettaratura, il mio studio si focalizzato sull'analisi delle proprietà ' meccaniche dell'intero genoma del batterio senza procede alla lisi della parete cellulare, perturbando quindi minimamente l'ambiente fisiologico in cui il nucleoide si organizza. Cellule di Escherichia coli sono state visualizzate in diverse fasi di crescita, dopo diverse procedure di essiccazione o sottoponendo le cellule a specifiche molecole intercalanti attraverso un procedura combinata AFM-FM. I dati ottenuti hanno permesso di correlare le modifiche morfologiche delle cellule con lo stato del nucleoide organizzato al loro interno. La medesima procedura di imaging ਠstato utilizzato anche nella caratterizzazione dei riarrangiamenti della membrana e del nucleoide di E. coli in seguito all' espressione di un piccolo peptide (Lpt) idrofobico appartenente al sistema tossina-antitossina di tipo I di Lactobacillus rhamnosus. L'espressione della tossina causa una notevole rifrangimento morfologico generale della cellula, che si manifesta attraverso la formazione sulla membrana di strutture simili a fori e la compattazione del nucleoide batterico. I dati raccolti hanno dimostrato la natura tossica del peptide, evidenziandone la tendenza a danneggiare l'integrità  strutturale di membrana.