Development of Surface Plasmon Resonance and Top-Down Mass Spectrometry Approaches to Monitor the Conformational Properties of Amyloidogenic Peptides and Their Enzymatic Cleavage: a Specific Application to Uncover the Mechanisms of Digestion of Branched Ubiquitin-Tau Proteoforms by the Human 20S Proteasome [Sviluppo di approcci di risonanza plasmonica di superficie e spettrometria di massa top-down per monitorare le proprietà conformazionali dei peptidi amiloidogenici e la loro digestione enzimatica: un'applicazione specifica per scoprire i meccanismi di digestione delle proteoforme ramificate di ubiquitina-tau da parte del proteasoma umano 20S]

Neurodegeneration onset and progression involve a diversified network of processes and components, such as protein folding, sorting, trafficking and turnover, immune system, neuroinflammation as well as genetic traits. A common histological hallmark of neurodegeneration is the accumulation of aggregated peptides or proteins in the intracellular and/or extracellular milieu upon loss of their physiological conformation. For this reason, neurodegenerative processes are often referred to as conformational diseases. Therefore, to monitor the conformation peptides and proteins involved in neurodegenerative processes adopt in solution and to investigate their susceptibility to proteolytic digestion is key to figure out the physico-chemical mechanisms of their aggregation and to explore strategies for their possible clearance in vivo. In this regard, Surface Plasmon Resonance (SPR) was here employed to accurately determine the diffusion coefficients of various molecules, including inorganic ions, small organic compounds, and proteins. The precision and efficiency of SPR for characterizing molecular diffusion proved to be essential for monitoring the conformational change of biomolecules in solution. This preliminary work has been then key to envision the application of this approach to macromolecules with proven relevance for neurodegeneration, such as the four repeat domain (4RD) domain of tau (MAPT gene). Tau is a cytoskeletal protein known to undergo conformational changes that promote its aggregation in different neuroanatomical regions of the brain during “tauopathies” onset. The SPR approach turned out to be effective to monitor the early aggregation of the 4RD-tau in vitro through determining the variation of its diffusion coefficient over a small time interval (3h), uncovering potential correlations with its conformation and oligomerization state. Since the pathological properties of tau in vivo are strongly influenced by factors such as post-translational modifications, including phosphorylation and ubiquitylation, the structural and functional role of site-specific ubiquitylation of 4RD tau has been here further explored. In this regard, site (K)-specific mono-ubiquitylated proteoforms of 4RD-tau were recently synthesized by enzymatic and semi-synthetic (disulfide coupling chemistry, Ub-S-S-proteoforms) reactions, namely: K18 (non-Ub); Ub-K18 (Ub installed by CHIP E3-ligase at different K sites); Ub-S-S-254; Ub-S-S-311; Ub-S-S-353. To address whether Ub position along the molecule affects the susceptibility of the protein to proteasomal cleavage, individual 4RD-tau preparations were fed to the human 20S (h20S). SDS-PAGE and top-down Mass Spectrometry (MS) experiments were then applied to investigate the pattern of degradation of the tau proteoforms and to monitor the release of the digestion fragments. The development of a new software called SpectraSage has been of fundamental importance for the analysis, identification and quantification, with no ambiguity, of digestion fragments in MS1 mode. Application of canonical proteomics softwares (Proteome Discoverer for enzymatic Ub) and SpectraSage (for site specific Ub proteoforms) have allowed to detect that: a) introduction of Ub by enzymatic reaction rendered the 4RD-tau susceptible to h20S mediated digestion, as non-Ub 4RD protein was resistant, and Ub was cleaved along with the protein substrate; b) h20S showed preferences for proteoforms with Ub installed at one out of the two termini (positions -254 and -353, respectively) whereas -311 was a poor substrate; c) Ub was cleaved along with the substrate but with aminoacidic preferences different from that of 4RD-tau. Therefore, this study supports the hypothesis that h20S can degrade mono-Ub proteins in vitro, introducing additional biochemical mechanisms regulating this phenomenon along with the catalytic preferences of the h20S.

L'insorgenza e la progressione della neurodegenerazione coinvolgono una rete diversificata di processi e componenti, come il ripiegamento, la selezione, il traffico e il turnover delle proteine, il sistema immunitario, la neuroinfiammazione e i tratti genetici. Un comune segno distintivo istologico della neurodegenerazione è l'accumulo di peptidi o proteine aggregate nell'ambiente intracellulare e/o extracellulare dopo la perdita della loro conformazione fisiologica. Per questo motivo, i processi neurodegenerativi sono spesso definiti malattie conformazionali. Pertanto, monitorare la conformazione adottata in soluzione dei peptidi e delle proteine coinvolti nei processi neurodegenerativi e indagare la loro suscettibilità alla digestione proteolitica è fondamentale per comprendere i meccanismi fisico-chimici della loro aggregazione ed esplorare strategie per la loro possibile eliminazione in vivo. A questo proposito, la risonanza plasmonica di superficie (SPR) è stata qui impiegata per determinare con precisione i coefficienti di diffusione di varie molecole, tra cui ioni inorganici, piccoli composti organici e proteine. La precisione e l'efficienza dell'SPR per la caratterizzazione della diffusione molecolare si sono dimostrate essenziali per monitorare il cambiamento conformazionale delle biomolecole in soluzione. Questo lavoro preliminare è stato quindi fondamentale per immaginare l'applicazione di questo approccio a macromolecole con comprovata rilevanza per la neurodegenerazione, come il dominio a quattro ripetizioni (4RD) della tau (gene MAPT). La tau è una proteina citoscheletrica nota per subire cambiamenti conformazionali che ne promuovono l'aggregazione in diverse regioni neuroanatomiche del cervello durante l'insorgenza delle "tauopatie". L'approccio SPR si è rivelato efficace per monitorare l'aggregazione precoce della 4RD-tau in vitro attraverso la determinazione della variazione del suo coefficiente di diffusione in un piccolo intervallo di tempo (3 ore), scoprendo potenziali correlazioni con la sua conformazione e lo stato di oligomerizzazione. Poiché le proprietà patologiche della tau in vivo sono fortemente influenzate da fattori quali le modifiche post-traduzionali, tra cui la fosforilazione e l'ubiquitinazione, il ruolo strutturale e funzionale dell'ubiquitinazione sito-specifica della tau 4RD è stato qui ulteriormente esplorato. A questo proposito, proteoforme mono-ubiquitinate sito-specifiche (K) della tau 4RD sono state recentemente sintetizzate mediante reazioni enzimatiche e semi-sintetiche (chimica di accoppiamento disolfuro, proteoforme Ub-S-S), vale a dire: K18 (non-Ub); Ub-K18 (Ub installato da CHIP E3-ligasi in diversi siti K); Ub-S-S-254; Ub-S-S-311; Ub-S-S-353. Per valutare se la posizione di Ub lungo la molecola influenzi la suscettibilità della proteina alla scissione proteasomale, singole preparazioni di 4RD-tau sono state somministrate al Proteasoma 20S umano (h20S). Sono stati quindi applicati esperimenti di SDS-PAGE e spettrometria di massa top-down (MS) per studiare il modello di degradazione delle proteoforme tau e per monitorare il rilascio dei frammenti di digestione. Lo sviluppo di un nuovo software chiamato SpectraSage è stato di fondamentale importanza per l'analisi, l'identificazione e la quantificazione, senza ambiguità, dei frammenti di digestione in modalità MS1. L'applicazione di software di proteomica canonica (Proteome Discoverer per Ub enzimatica) e SpectraSage (per proteoforme di Ub sito-specifiche) ha permesso di rilevare che: a) l'introduzione di Ub tramite reazione enzimatica rende la 4RD-tau suscettibile alla digestione mediata da h20S, poiché la proteina 4RD non-Ub è resistente e Ub viene scissa insieme al substrato proteico; b) h20S mostra preferenze per proteoforme con Ub installata in uno dei due termini (rispettivamente posizioni -254 e -353) mentre -311 non è un buon substrato; c) Ub viene scissa insieme al substrato ma con preferenze aminoacidiche diverse da quelle di 4RD-tau. Pertanto, questo studio supporta l'ipotesi che h20S possa degradare le proteine mono-Ub in vitro, introducendo ulteriori meccanismi biochimici che regolano questo fenomeno insieme alle preferenze catalitiche dell'h20S.