Meccanismi biochimici coinvolti nell'apoptosi CpHV-1-indotta

Lࢠapoptosi àƒ¨ un processo fisiologico presente in tutti gli eucarioti multicellulari che si verifica durante le prime fasi dello sviluppo. Morfologicamente, lࢠapoptosi risulta caratterizzata da vacuolizzazione del citoplasma, condensazione della cromatina e formazione di corpi apoptotici, mentre da un punto di vista biochimico si distingue per lࢠattivazione di proteasi specifiche (caspasi) e per la degradazione del DNA in frammenti oligonucleosomiali. Gli eventi apoptotici possono essere indotti da molteplici stimoli intra-cellulari (danni al DNA, gravi stress al reticolo endoplasmatico o ai mitocondri) e/o extra-cellulari (azione di ormoni e di fattori di crescita; infezioni virali). In particolare, nellࢠapoptosi virus-indotta, gli Herpesvirus sembrano esercitare un fine controllo della risposta apoptotica cellulare, attraverso il coinvolgimento di meccanismi ancora non completamente conosciuti. Caprine Herpesvirus 1 (CpHV-1) àƒ¨ responsabile di infezioni sistemiche che colpiscono i capretti nelle prime due settimane di vita, con febbre, scolo nasale, diarrea. Ma il virus àƒ¨ stato isolato anche da capre con vulvovaginite, turbe respiratorie e lesioni proliferative a carico di labbra e palato duro. Inoltre, àƒ¨ in grado di esplicare attivitàƒ abortigena e, al pari di altri Herpesvirus, dàƒ luogo ad infezioni latenti suscettibili di riattivazione. Eࢠnoto che CpHV-1 sia in grado dࢠindurre apoptosi in cellule mononucleate di sangue (Pagnini et al., 2005), al pari di BoHV-1 (Hanon et al., 1997, 1998; Winkler et al., 1999; Delhon et al., 2002), antigenicamente e geneticamente correlato ad esso. Dal momento che BoHV-1 induce apoptosi anche in cellule di origine epiteliale (Devireddy & Jones, 1999; Geiser et al., 2008), abbiamo studiato la capacitàƒ di CpHV-1 di indurre apoptosi, utilizzando come modello sperimentale la linea cellulare Madin Darby bovine kidney (MDBK), oggetto di questa tesi. Inoltre, sono state messe in luce alcune caratteristiche del processo apoptotico che si verifica in questo substrato. Pertanto, la descrizione della capacitàƒ di CpHV-1 di interagire con i meccanismi che presiedono alla morte cellulare programmata potrebbe aprire nuove prospettive nella comprensione dei meccanismi che sottintendono la patogenesi dellࢠinfezione causata da questo virus. La scelta dellࢠargomento àƒ¨ correlata alla necessitàƒ di comprendere i meccanismi patogenetici che portano alle manifestazioni cliniche da CpHV-1, diffuso in diversi Paesi del Mediterraneo e, in particolare, in alcune regioni del sud Italia, dove provoca gravi perdite economiche, sia per i disordini riproduttivi di cui àƒ¨ direttamente responsabile, sia per le infezioni secondarie conseguenti allo stato di immunosoppressione degli animali. In seguito allࢠinfezione delle cellule MDBK con CpHV-1, a differenti molteplicitàƒ dࢠinfezione (m.o.i.) (0.1, 1 e 10), si àƒ¨ riscontrata una riduzione della vitalitàƒ cellulare in maniera dose-tempo dipendente, utilizzando un saggio colorimetrico che misura lࢠattivitàƒ metabolica cellulare (MTT test). Inoltre, àƒ¨ stata evidenziata lࢠassociazione tra la diminuzione di vitalitàƒ cellulare e la produzione di nuova progenie virale. A partire da 12 ore post infezione (p.i.), la morfologia cellulare àƒ¨ apparsa drasticamente cambiata: le cellule, arrotondate, si staccavano dal monostrato infettato e, impiegando la colorazione con arancio dࢠacridina, àƒ¨ stato possibile visualizzare la frammentazione nucleare. Il ladder internucleosomiale tipico dellࢠapoptosi àƒ¨ stato rilevato giàƒ a 24 ore p.i. Il fenomeno apoptotico àƒ¨ stato, poi, quantificato mediante colorazione del DNA delle cellule infette con propidio ioduro, metodica che mette in evidenza il picco ipodiploide corrispondente alle cellule apoptotiche e ai corpi apoptotici. Il picco si apprezzava giàƒ a 8 ore p.i. nelle cellule infettate alle m.o.i piàƒ¹ alte (1 e 10), e a 24 ore p.i. a m.o.i 0.1. Tra i meccanismi coinvolti nellࢠapoptosi, attraverso analisi western blotting e citofluorimetria a flusso, àƒ¨ stato dimostrato che lࢠapoptosi indotta da CpHV-1 àƒ¨ associata allࢠattivazione sia di caspasi iniziatrici, quali caspasi-8 e caspasi-9, sia di caspasi effettrici, come caspasi-3. àƒ stato evidenziato, inoltre, il clivaggio di PARP, enzima di riparo del DNA, necessario alla sopravvivenza cellulare, a partire da 8 ore p.i. Lo studio dellࢠeffetto degli inibitori specifici delle caspasi sullࢠinfezione da CpHV-1, àƒ¨ stata riscontrata la liberazione di nuova progenie virale. I segnali che conducono alla morte cellulare programmata possono provenire sia dalle interazioni di ligandi extracellulari a recettori specifici esposti sulla membrana plasmatica, che da eventi apoptotici mitocondriali. Alcuni effetti che si riflettono sulla funzionalitàƒ mitocondriale riguardano il calo della differenza del potenziale transmembranario (??m) e la liberazione del citocromo C eventi che in questo lavoro sono stati apprezzati giàƒ a 8 ore dallࢠinfezione. La modulazione tra segnali di morte e di sopravvivenza che coinvolgono la cellula durante lࢠapoptosi àƒ¨ effettuata da diverse proteine, come la famiglia Bcl-2 che comprende sia membri pro-apoptotici (come Bax o Bid), che anti-apoptotici (Bcl-XL e Bcl-2). Nelle cellule infettate con CpHV-1, àƒ¨ stato dimostrato che sia lࢠmRNA di Bax che la proteina erano presenti a partire da 8 a 24 ore p.i., quando appunto Bid risultava attivato. Rispetto al controllo, i livelli di mRNA dei membri antiapoptotici studiati rimanevano invariati nel corso dellࢠinfezione, mentre lࢠespressione delle proteine relative era inferiore giàƒ a partire da 8 ore p.i. Questi risultati dimostrano che non cà¢ àƒ¨ alcuna interferenza da parte del virus nella trascrizione dei geni della famiglia Bcl-2. Quindi la regolazione dellࢠespressione di Bcl-2 dipende dalle caspasi, attive giàƒ a 8 ore p.i. I dati riportati in questo lavoro dimostrano chiaramente che CpHV-1 àƒ¨ in grado di indurre apoptosi in cellule MDBK, cosàƒ¬ come accade in altri substrati quali le PBMC (Pagnini et al., 2005). Inoltre, in confronto allࢠapoptosi BoHV-1-indotta in cellule MDBK, dove gli eventi apoptoci sono stati descritti nelle utime ore dellࢠinfezione (Devireddy & Jones, 1999; Geiser et al., 2008), CpHV-1 provoca precocemente apoptosi nelle MDBK, anche se cellule di origine epiteliale, che generalmente risultano piàƒ¹ resistenti alla morte cellulare programmata (Wesselborg et al., 1993). Lࢠapoptosi delle cellule infettate causa la distruzione dei tessuti e delle cellule stesse, cosàƒ¬ come le risposte infiammatorie. Di conseguenza, nelle infezioni associate al CapHV-1, lࢠapoptosi delle cellule costituenti i tessuti dellࢠapparato respiratorio e genitale potrebbe essere responsabile delle manifestazioni patologiche determinate dal virus.