IDENTIFICAZIONE ED ANALISI FUNZIONALE DI GENI MEIOTICI IN PIANTA

Il lavoro svolto nella presente tesi ha avuto lo scopo di approfondire le conoscenze relative al processo meiotico in una specie modello, Arabidopsis thaliana, e in una specie di interesse agrario, il pomodoro (Solanum lycopersicum). In Arabidopsis sono stati perseguiti due obiettivi in accordo con il progetto europeo “Systematic Analysis of Factors Controlling Meiotic Recombination in Higher Plants (MeioSys)” nell'ambito del quale ਠstato effettuato, in parte, questo lavoro di tesi: - comprendere il ruolo dell'acetilazione istonica in meiosi; - determinare lo stato dell'acetilazione e della metilazione istoniche nelle fasi della meiosi. Il primo obiettivo ਠstato perseguito mediante l'analisi sistematica di 31 geni identificati in silico e codificanti per 18 deacetilasi istoniche (HDAC) e 13 acetilasi istoniche (HAT). Tale analisi si ਠbasata sull'impiego di linee di tipo inserzionale (linee SALK e linea CS 31355) o RNAi, ottenute dal NASC. La selezione, effettuata mediante analisi fenotipiche, molecolari e di vitalità  pollinica, ha consentito l'identificazione di una linea (CS 31355) che ha un'inserzione nel gene HDA19 e presenta riduzione nella fertilità  della siliqua e del polline. Tale linea caratterizzata da anomalie nei processi meiotici dell'appaiamento, formazione dei crossing-over e segregazione, evidenzia un ruolo meiotico per la deacetilasi istonica HDA19 e analogie con il mutante iper-acetilato Atmcc1, precedentemente caratterizzato presso l'IGV di Portici. Indagini bioinformatiche hanno indicato che altri geni codificanti HDAC, HDA6 ed HDA7, erano candidati ad avere un ruolo in meiosi. La linea RNAi per il gene HDA6 e quella inserzionale per HDA7 non hanno presentato anomalie nà© a livello fenotipico nਠdi fertilità  pollinica. I dati derivanti dall'analisi di espressione hanno indicato che la linea RNAi per HDA6 non ਠeffettivamente un “null mutant” e che la linea SALK per HDA7 ha questo gene sovraespresso con l'inserzione che agisce come †˜activation-tagging'. Per entrambe le deacetilasi non ਠpossibile, quindi, escludere un loro ruolo in meiosi. In conclusione, tramite l'impiego delle linee SALK ed RNAi ਠstata identificata una deacetilasi istonica (HDA19) con ruolo in meiosi, pur essendosi evidenziate alcune limitazioni legate alle caratteristiche delle linee stesse. Infatti le linee SALK non sempre hanno rispettato le caratteristiche indicate dal NASC rispetto allo stato genetico dell'inserzione. Inoltre, in alcuni casi, si sono verificate l'assenza dell'inserzione o la presenza di inserzioni in pi๠geni. Il secondo obiettivo ਠstato quello stabilire lo stato dell'acetilazione e, parzialmente, della metilazione istoniche durante la microsporogenesi in Arabidopsis non essendo mai stato descritto in pianta. A questo scopo sono stati impiegati anticorpi in grado di riconoscere i residui di lisina (K) acetilati sull'istone H3 (H3K9K14; H3K9) ed H4 (H4K5; H4K16) e trimetilati sull'istone H3 (H3K4). I risultati hanno mostrato che gli istoni H3 ed H4 sono acetilati nelle diverse fasi meiotiche e che l'acetilazione dell'H3 ਠpi๠debole nella sottofase zigotene. Questa osservazione ਠin accordo con i dati di letteratura, in base ai quali risulta che un basso livello di acetilazione dell'H3 in profase I ਠnecessario per una corretta progressione della meiosi. Anche l'acetilazione dell'H4 ਠrisultata stabile laddove era ipotizzabile una dinamica, soprattutto per il residuo K16, in relazione al comportamento dei cromosomi. àˆ infatti noto che l'acetilazione della lisina 16 dell'H4 ha un ruolo nella decondensazione della cromatina. Per la metilazione del residuo K4 dell'istone H3 risulta trimetilato in tutte le fasi della meiosi e non ਠpresente sull'eterocromatina in accordo con l'osservazione che l'H3K4me3 ਠuna modifica associata all'eucromatina. I risultati ottenuti confrontati con quelli della meiosi di mammifero hanno mostrato che i pattern delle modifiche istoniche nella meiosi in pianta sono differenti. Questo potrebbe indicare una diversificazione nella regolazione della cromatina e riflettere le differenze tra i pattern di crescita e sviluppo delle piante rispetto ai mammiferi. La relativa stabilità  delle modifiche istoniche durante la meiosi considerata nella presente tesi a livello globale, tuttavia, non esclude che possano esserci variazioni a livello locale. In Solanum lycopersicum l'obiettivo del lavoro di tesi, svolto nell'ambito del progetto MIUR Genopom, ਠstato la messa a punto di una strategia di Laser Microdissection Microarray (LMM) per identificare geni espressi in meiosi, con particolare interesse per quelli responsabili dell'acetilazione/deacetilazione istonica in pomodoro. Il confronto ਠstato effettuato tra le cellule madri del polline (microsporociti) nello stadio pre-meiotico/meiotico e le microspore nello stadio uni- e bi-nucleato. Questo approccio, che combina la tecnologia Laser Capture Microdissection (LCM) e l'analisi microarray, ha consentito l'isolamento di 268 geni, di cui 112 specifici e 156 up-regolati durante la meiosi di pomodoro. L'annotazione di questi geni, sebbene parziale e rappresentativa di una parte del genoma, ha indicato la presenza, tra i geni meiosi-specifici, di due geni noti per essere espressi in meiosi, meiotic serine proteinasi e rad51. Questo risultato, insieme all'assenza di geni specifici del tappeto, la cui presenza sarebbe stata indice di cellule diverse dai meiociti, evidenzia la specificità  del tipo di cellule isolate con LCM. L'annotazione, infine, ha consentito di individuare due deacetilasi istoniche espresse in maniera specifica nei meiociti e dunque con un putativo ruolo in meiosi.