Determinazione dei peptidi negli alimenti mediante HPLC-ESI-MS: correlazione con i trattamenti tecnologici e attività biologica

La proteolisi rappresenta il pi๠complesso e, in molti casi, il pi๠importante tra i fenomeni biochimici che hanno luogo nei formaggi durante la fase di maturazione, e contribuisce in modo decisivo allo sviluppo delle caratteristiche finali del formaggio stesso, in quanto i peptidi che ne derivano svolgono un ruolo fondamentale nel determinare le proprietà  funzionali, nutrizionali, e sensoriali dell'alimento. L'interesse per gli oligopeptidi originati dalla degradazione delle proteine alimentari ਠinoltre incrementato dalla scoperta che molti di essi sono biologicamente attivi; si tratta di molecole che risultano inattive quando sono presenti nella sequenza della proteina nativa, ma che assumono attività  farmacologica nel momento in cui vengono liberati. Un gran numero di peptidi ad attività  oppioide o ACE-inibitrice sono stati isolati a partire da digeriti enzimatici di diverse proteine alimentari, sia di origine animale che vegetale; da questo punto di vista le proteine del latte, caseine in particolare, rappresentano una fonte molto importante di peptidi bioattivi, quali le casomorfine ed i caseinofosfopeptidi. In una prima parte del lavoro di tesi ਠstata valutata l'efficacia dell'analisi HPLC-ESI-MS applicata allo studio della frazione oligopeptidica di diversi formaggi, al fine di seguirne le variazioni nel corso della stagionatura. Sono state analizzate sia tipologie di formaggi da latte ovino (pecorino) che da latte vaccino (caciotta), e per entrambe sono state studiate tre diverse tecnologie produttive (da latte crudo, da latte omogeneizzato con alte pressioni, e da latte pastorizzato), con lo scopo di valutare se e come la diversa tecnologia possa influenzare la composizione della frazione oligopeptidica, e quindi le diverse caratteristiche che funzionali ed organolettiche dei prodotti. L'analisi della frazione peptidica mediante HPLC-ESI-MS si ਠmostrata particolarmente efficace nel distinguere i formaggi a diversa tecnologia di produzione, in quanto il profilo peptidico appare estremamente distintivo del trattamento di sanitizzazione subito dal latte; in particolare i campioni da latte pastorizzato mostrano un andamento molto diverso rispetto a quelli da latte crudo ed omogeneizzato, tra loro piuttosto simili. L'analisi statistica applicata ai dati ha permesso, inoltre, di ipotizzare possibili percorsi proteolitici. Dal confronto tra la frazione oligopeptidica di formaggi da latte vaccino e quella di formaggi da latte ovino, ਠstato possibile evidenziare la presenza di sequenze peptidiche derivanti da siti di taglio comuni tra le caseine ovine e bovine; tali peptidi hanno la stessa localizzazione nella sequenza caseinica, ma possono differire per alcuni residui amminoacidici, rappresentando, in questo modo, dei potenziali marker del latte di origine. In particolare abbiamo focalizzato l'attenzione sul frammento ?S1-CN(f1-14), che ਠfortemente rappresentato in entrambe le tipologie di formaggio, ma con diversi pesi molecolari (1624Da per la sequenza ovina, 1665Da per quella vaccina); il suo utilizzo come marker di origine del latte ha permesso di rivelare adulterazioni già  al 5% di taglio di latte ovino con quello vaccino. In una seconda parte del lavoro di tesi, si ਠinvestigata la potenziale bioattività  di peptidi naturalmente presenti nel Parmigiano Reggiano, focalizzando l'attenzione sull'attività  ACE-inibitrice ed immunomodulante. Per quanto riguarda l'attività  di ACE-inibizione, ਠstato utilizzato un test spettrofotometrico molto affidabile e veloce, che ci ha consentito di testare sia singoli peptidi naturalmente presenti nei formaggi, e sintetizzati in laboratorio, sia miscele peptidiche a maggiore complessità  estratte dai formaggi, frazionate per via cromatografica e caratterizzate mediante HPLC-ESI-MS. Per la valutazione dell'attività  immunomodulante sono stati invece utilizzati in parallelo due metodi colorimetrici in micropiastra, condotti sui linfociti T umani Jurkat presso i Laboratoire de Recherche en Genie Industriel Alimentaire (LRGIA) dell'Università  “Claude Bernard” di Lioni, in collaborazione con il gruppo di ricerca della prof.ssa Martial: tale metodologia ਠrisultata particolarmente versatile ed efficace, ed ha mostrato ancora una volta una buona affidabilità  sia nel caso di estratti di formaggio che di molecole singole. La frazione oligopeptidica estratta dal Parmigiano Reggiano ha mostrato una buona capacità  immunostimolante, ed il suo successivo frazionamento in HPLC preparativo ha consentito di evidenziare le singole frazioni responsabili per tale attività , principalmente quelle ad elevato peso molecolare. Buoni risultati si sono, inoltre, ottenuti quando il test ਠstato eseguito su singole molecole naturalmente presenti nei formaggi. Infine, in una terza parte della tesi ਠstata valutata la potenzialità  della digestione triptica, congiunta ad analisi HPLC-MS della miscela peptidica derivante, al fine di ricavare informazioni sulla sequenza di una proteina allergenica: si ਠfocalizzata l'attenzione sulla lipid transfer protein (LTP) della pesca, Pru p 3, allergene noto in letteratura per la sua elevata resistenza ai trattamenti termici ed alla digestione enzimatica. Tale resistenza alla digestione enzimatica deriva dal fatto che la LTP della pesca, come tutte le LTP finora note, ਠcaratterizzata dalla presenza di 8 residui di cisteina altamente conservati, che si organizzano a formare 4 ponti disolfuro responsabili della conformazione altamente ripiegata della proteina; a tale proposito, particolarmente efficace si ਠrivelata l'idea di effettuare la riduzione dei ponti disolfuro, e la successiva alchilazione dei residui di cisteina liberi, non sulla proteina tal quale, ma sulla miscela di peptidi derivanti dalla digestione triptica della proteina. Una procedura di questo tipo ci ha permesso di ottenere informazioni utili sulla sequenza proteica grazie all'ottenimento dei peptidi corrispondenti al core centrale, difficilmente accessibile.