RUOLO DELLA SELENIOPROTEINA GLUTATIONE PEROSSIDASI IDROSSIDO FOSFOLIPIDE (PHGPx) NELLA SPERMATOGENESI DI VERTEBRATI NON MAMMIFERI

La Glutatione Perossidasi Idrossido Fosfolipide (PHGPx/GPx4) ਠuna selenioproteina che appartiene alla superfamiglia delle glutatione perossidasi. Condivide con le altre glutatatione perossidasi il meccanismo catalitico, che comprende l'ossidazione, in presenza di un idroperossido, del selenolato del sito attivo a derivato dell'acido selenenico, la riduzione di questo da parte del glutatione (GSH) con formazione di un selenodisolfuro e quindi la rigenerazione dell'enzima nativo da parte di una seconda molecola di cosubstrato riducente (Shi et al., 2010). Tra le glutatione perossidasi, PHGPx ਠla meno specifica; non solo riduce un ampio spettro di idroperossidi, ma accetta anche diversi tipi di tioli come riducenti (compresi i di-tioli). La selenoperossidasi PHGPx viene descritta come enzima chiave implicato nella regolazione cellulare, nell'apoptosi, nella costruzione di strutture sopramolecolari e nel differenziamento; particolarmente rilevante appare la capacita' della PHGPx di ossidare tioli proteici nelle fasi finali della spermatogenesi (Ursini et al., 1999). Similmente al GPx citosolico ਠpresente in molti tessuti, ma contrariamente al GPx i suoi livelli e il suo pattern di espressione nel testicolo sono pi๠alti che in ogni altro tessuto, incluso il fegato (Maiorino et al., 2003; Diaconu et al., 2006). Il gene umano della PHGPx ਠlocalizzato sul cromosoma 19 e risulta composto da sette esoni distribuiti su 3-4 kb di DNA (Imai e Nakagawa, 2002). Il gene ਠtrascritto in mRNA di diversa lunghezza che danno origine a tre isoforme che indirizzano la proteina in diversi compartimenti e che differiscono per la loro estensione N-terminale: un mRNA citosolico (cPHGPx), nucleare (nPHGPx) e mitocondriale (mPHGPx) (Puglisi et al., 2005). In condizioni di potenziali redox elevati (ad es. basse concentrazioni intracellulari di GSH) e una fonte di perossidi, PHGPx catalizza l'ossidazione di specifici tioli proteici. Questa reazione ਠassociata ad almeno due eventi rilevanti per la funzione riproduttiva: la compattazione della cromatina (Puglisi et al., 2005) e la formazione della capsula mitocondriale (Nayernia, 2002). L'isoforma nucleare in particolare, ਠcoinvolta nel processo di condensazione della cromatina, che si verifica negli steps finali di spermatogenesi e che richiede la sostituzione della maggioranza degli istoni con proteine di transizione e protammine ritenute essenziali per la stabilizzazione del DNA e la condensazione dei spermatociti. La formazione della capsula mitocondriale richiede le "proteine ricche di cisteine associate ai mitocondri degli spermatozoi" (SMCP); infatti uno dei principali aspetti della funzione della PHGPx ਠla catalisi operata su cisteine adiacenti in specifiche proteine che possono funzionare come "interruttori redox" e che possono "accendere" o "spegnere" specifiche funzioni biologiche o la formazione di aggregati sopramolecolari: ciಠsuggerisce il ruolo del selenio nella protezione dai residui chimici libero-radicali altamente reattivi, che sono collegati alla sterilità  maschile (Maiorino e Ursini, 2002). Le cause che contribuiscono ad avere soggetti infertili, prevedono a monte la valutazione del quadro ormonale: quindi il bilancio tra le azioni degli androgeni e estrogeni puಠessere importante ai fini del mantenimento della spermatogenesi. Tramite l'induzione della spermatogenesi, ਠstato provato che gli ormoni steroidei non stimolano direttamente la trascrizione genica e che, in vivo, il testosterone media l'espressione della PHGPx (Maiorino et al., 1998). Inoltre, l'espressione di PHGPx nei vertebrati mammiferi puಠessere controllata dagli estrogeni negli organi riproduttori maschili (testicoli, epididimo, prostata). Il 17? estradiolo, un estrogeno intrinseco nei vertebrati, ha il suo recettore espresso nei testicoli durante l'intero processo di spermatogenesi (O'Donnell et al., 2001). L'espressione del trascritto di PHGPx incrementa in seguito al trattamento con 17? estradiolo, per cui il recettore ? che funziona come un regolatore dominante del segnale degli estrogeni risulta correlato con PHGPx (Pettersson et al., 2000; Nam et al., 2003). Da ciಠemerge che nei mammiferi gli estrogeni esogeni influenzano il pattern di espressione del gene di PHGPx tramite il recettore ? (Sang et al., 2003). Partendo da questa base scientifica ho utilizzato come modello sperimentale il maschio di un vertebrato non mammifero con tipica riproduzione stagionale, il Lacertidae Podarcis sicula il cui noto meccanismo riproduttivo ਠinfluenzato da molteplici fattori molecolari che governano le numerose ed importanti relazioni che si instaurano lungo l'asse ipotalamo-ipofisi-gonade (Guerriero, 2009). Dalla letteratura risulta ben evidente il ruolo svolto da diversi fattori endogeni ed esogeni sulla spermatogenesi del modello sperimentale oggetto della ricerca. In particolare ਠevidente che lo steroide testosterone eserciti un rilevante effetto regolatore sulla spermatogenesi e sullo sviluppo e funzione del sistema riproduttivo anche se la localizzazione di recettori degli estrogeni ? nelle cellule del Sertoli e nelle cellule germinali suggerisce che gli estrogeni esercitino un'influenza diretta sulla funzione e maturazione delle cellule germinali (Chieffi e Varriale, 2004). Ciಠsolleva la possibilità  che alcuni degli effetti del testosterone sulla spermatogenesi potrebbero verificarsi direttamente sulle cellule germinali dopo conversione del testosterone ad estradiolo, suggerendo una relazione funzionale tra steroidi e PHGPx. Pertanto Podarcis sicula in qualità  di riproduttore stagionale si pone come modello sperimentale idoneo a definirne gli eventi che regolano la spermatogenesi a partire dalla identificazione e caratterizzazione della sequenza nucleotidica di PHGPx e dallo studio delle sue variazioni stagionali di espressione nel ciclo riproduttivo. Il progetto e' stato pianificato in modo da ottimizzare l'integrazione di approcci biochimici con metodiche di biologia molecolare e di bioinformatica. Usufruendo della stagionalità  riproduttiva del modello sperimentale, ho valutato biochimicamente la presenza e le variazioni stagionali della selenioproteina PHGPx mediante analisi di Western blotting in diversi tessuti (testicolo, encefalo, fegato e intestino) servendomi dell'anticorpo policlonale anti-PHGPx (Abnova, PAB 1206). L'analisi di Western blotting condotta, ha permesso di segnalare che l'anticorpo cross reagisce anche su tessuti di rettili evidenziando una banda del peso molecolare di circa 20kDa. L'analisi quantitativa densitometrica nei diversi tessuti conferma come per i mammiferi (Diaconu et al., 2006), una predominante espressione di PHGPx nel testicolo, con un incremento del segnale in piena attività  spermatogenetica; l'intestino mostra la pi๠scarsa attività  di PHGPx nelle fasi del ciclo esaminate. Inoltre, il ciclo riproduttivo di Podarcis sicula ਠfacilmente manovrabile, agendo su fotoperiodo e temperatura ਠstato possibile favorire o meno la ripresa dell'attività  spermatogenetica. Ho scelto quindi di studiare l'espressione del pattern proteico di PHGPx dopo trattamenti sperimentali eseguiti rispettivamente nella fase di stasi riproduttiva e nella fase di massima attività  gonadica. Il trattamento con la gonadotropina corionica umana (HCG) condotto durante la stasi riproduttiva incrementa l'immunoreattività  di PHGPx dopo 21 giorni di manipolazione, mentre il trattamento con l'antagonista del recettore degli estrogeni ICI 182-780 condotto durante la massima attività  gonadica induce una riduzione del segnale di PHGPx dopo 21 giorni. I risultati dei trattamenti sperimentali mettono in evidenza come, anche in Podarcis sicula, l'attività  della selenioproteina PHGPx sia strettamente correlata all'attività  spermatogenetica; inoltre esiste una dipendenza ormonale dell'espressione di PHGPx con gli estrogeni, che come ਠnoto innescano il meccanismo di spermatogenesi e svolgono un ruolo fisiologico nella fertilità  maschile (Carreau et al., 2011). Lo studio biochimico, come accennato, ਠstato integrato a quello di biologia molecolare e bioinformatico. La regione parzialmente clonata di cDNA dal testicolo di Podarcis sicula ਠdi 340 bp.