Molecular mechanism regulating post-translational control of PED/PEA-15 expression

PED/PEA-15 (Phosphoprotein Enriched in Diabetes/Phosphoprotein Enriched in Astrocytes-15) àƒ¨ una proteina di 15 kDa sovraespressa in pazienti con diabete mellito di tipo 2. La sovraespessione di PED/PEA-15 in cellule in coltura e in topi transgenici altera lࢠazione dellࢠinsulina. Inoltre, i topi transgenici sovraesprimenti PED/PEA-15 mostrano una maggiore suscettibilitàƒÂ  alla formazione di tumori della pelle indotti chimicamente. Numerose evidenze indicano che lࢠespressione della proteina PED/PEA-15 àƒ¨ finemente regolata dal suo stato di fosforilazione, in particolare, la proteina PED/PEA-15 àƒ¨ fosforilata sulla serina 116 da CaMKII e da Akt/PKB e tale fosforilazione regola la sua emivita. In questo lavoro ho studiato la capacitàƒÂ  della proteina chinasi C (PKC) di regolare i livelli di espressione della proteina PED/PEA-15. In cellule 293, sovraesprimenti stabilmente PED/PEA-15, la stimolazione con TPA, un potente attivatore di PKC, induce un significativo aumento dei livelli di espressione di PED/PEA-15. Il medesimo effetto del TPA àƒ¨ stato osservato anche in cellule HeLa e in cheratinociti che esprimono livelli endogeni di PED/PEA-15. In seguito ho usato oligonucleotidi antisenso fosforotioati per inibire le singole isoforme di PKC. Il trattamento di cellule 293PED con lࢠantisenso di PKC? ha ridotto lࢠespressione di PED/PEA-15 suggerendo che PKC? endogeno selettivamente regola i livelli di PED/PEA-15. Inoltre, lࢠinibizione di PKC? previene lࢠaumento dellࢠespressione di PED/PEA-15 indotto dal TPA. Indi ho studiato la regolazione dellࢠespressione di PED/PEA-15 da parte del TPA in cellule 293 stabilmente trasfettate con PEDwt e con i mutanti PEDS104G o PEDS116G. La stimolazione con TPA ha incrementato di 4 volte i livelli di PEDwt e PEDS104G ma non àƒ¨ stata in grado di indurre un aumento dei livelli di PEDS116G. Anche la sovraespressione del cDNA di PKC? in cellule 293 esprimenti PEDwt o PEDS104G ha indotto un incremento significativo dellࢠespressione di PED/PEA-15 mentre non ha avuto alcuno effetto sullࢠespressione di PEDS116G. Inoltre ho anche dimostrato che PED/PEA-15 àƒ¨ ubiquitinata e che tale ubiquitinazione àƒ¨ regolata dal TPA. Infine, la lactacistina, un inibitore del proteosoma, ha revertito lࢠeffetto del blocco dellࢠantisenso di PKC? sullࢠespressione di PED/PEA-15. Quindi in questo lavoro di tesi ho mostrato che PKC? regola lࢠespressione di PED/PEA-15 inibendo la sua degradazione nel compartimento proteosomale. Ciàƒ² potrebbe essere parte di un meccanismo attraverso il quale lࢠiperattivazione di PKC altera lࢠazione dellࢠinsulina negli stati di insulino-resistenza e/o promuove la formazione di tumori.